植物基因表达的启动子

CAAT框(CAAT box)
TATA框(TATA box)
2.上游启动子元件(upstream promoter element): 包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及
距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的
蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具 有不同的上游启动子元件，其位置也不相同，这使 得不同的基因表达分别有不同的时间与空间表达调 控。这些上游启动子元件中，最普遍的是增强子元
2.特异启动子
•
在基因工程中利用组成型启动子高表达基因常常 带来许多麻烦，如影响植物的正常生长发育，转基 因植物安全性等问题，所以我们希望在时空上能够 控制基因的表达，因此就要用细胞、组织、器官特 异启动子。
转35S-Kn1-Nos基因的烟草 转35S-Kn1-Nos基因的地黄
2.1组织特异启动子（tissue-specific promoter） 就是只在特定的组织或者器官（根、叶片、子 房、花粉、花原基、种皮等）中起作用的启动 子。
12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强
子的作用有以下特点：
①增强子可以远距离作用。通常可距离1-4 kb、 个别情况下离开所调控的基因30kb仍能发挥作 用，而且在基因的上游或下游都能起作用。 ②增强子作用与其序列的正反方向无关。将增
强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒就
不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同 的。
•
利用病毒来源的启动子进行植物转基因有 令人担心的问题，如： • 转基因食物与感染人类的病毒存在时， 启动子可能与病毒基因重组、导致病毒基 因的大量表达。 • 植物细胞可能不识别病毒来源的启动子 序列，把它当作外源DNA，对它进行修饰、 使它失去作用，导致基因沉默。
原核生物组成型启动子之二： 农杆菌胭脂碱合成酶基因启动子 Nos promoter
带增强子的35S启动子
NcoI(2400) SacI(300) EcoRI(1) 2X CaMV35S XhoI(15500) Hygromycin XhoI(14500) polyA LB nos NheI(7250) Kanamycin RB pCambia-Agl5-iaaM GUSplus 16500bp SalI(1430) 1 nos iaaM SalI(4500) PstI Agl5 SphI HindIII(4520) lacZ 35S P NcoI(5200) BglII(5206)
卫矛 Nos promoter
Nos promoter 烟草 35S promoter
1.2 植物来源的组成型启动子
• 在植物中有很多看家基因，在各种类型细胞和 所有时间内都表达。启动这些基因表达的启动子 就是组成型启动子。现在许多这类启动子已经被 克隆，并在植物基因工程得到了应用。 • 肌动蛋白（actin）是细胞基本骨架的成分， actin基因家族的基因都是组成型基因，其启动子 就是组成型启动子。通过检测报告基因的表达， 发现1.5kb的拟南芥actin2基因启动子几乎在拟南 芥所有器官和整个发育过程中都起作用，仅在种 皮、胚轴、子房和花粉囊中不起明显作用。 • 水稻的actin1基因启动子仅不在木质部中起作用。
拟南芥ACTIN2基因启动子分析
• Ubiquitin（泛素蛋白）也是细胞中重要的 基本成分，参与了许多重要生命过程，如 蛋白质转运、染色质结构、DNA修复等。 来自玉米的Ubiquitin1基因的启动子（pUbi） 是用得比较多的植物启动子之一，特别是 在单子叶植物中，在玉米中pUbi的作用是 35S启动子的10倍。 • 来自烟草的Ubi.U4基因的启动子(-263bp) 在烟草中的作用比35S启动子好。
2.3种子/籽粒特异启动子
• 种子/籽粒是很多植物的收获器官，具有重要经济 价值，其质量和品质一直受到人们的关注，如食 品中蛋白质、油脂、维生素的含量提高、棉花纤 维长度的提高、有用物质（蛋白、酶、疫苗的生 产等）都可以通过种子/籽粒特异启动子启动有关 基因的表达而实现。这类启动子有： • soybean β-conglycinin基因启动子在胚成熟的中、 后期起作用；sunflower helianthinin基因启动子在 发育的种子中起作用；French bean β –phaseolin 基因启动子只在发育的种子的胚乳和胚起作用； cotton a-globulin 基因启动子可以在棉花、烟草、 拟南芥发育的种子中起作用。 • 种皮特异启动子：A pea β -1,3-glucanase 基因 （PsGNS2）只在种皮中起作用。
植物维管组织特异启动子
• 2.2果实特异性启动子 • 果实是食用器官，利用果实特异性启动子可以 改良果实品质、生产疫苗。 • 苹果和番茄果实中1-aminocyclopropane-1carboxylate (1-氨基环丙烷-1-羧酸，ACC) oxidase gene（ E8 gene）和polygalacturonase (多聚半乳糖醛酸酶，PG) genes 启动子在果实成 熟是起作用。番茄PG启动子用来提高番茄果实中 胡萝卜素的含量；番茄E8启动子表达virus-F protein，生产疫苗，提高了老鼠系统免疫能力。
35S启动子的核心长度为60bp左右；其上游有其它元件，控 制启动子的转录效率和特异性，其中包括增强子。
Domain A:与在根部起作用有关。
Domain B：是烟草转录因子ASF-1的结合部位，与在植物叶片、茎等绿色 组织中起作用有关。 -343 -90 +9
增强子 上游部分：与转录强度有关（增强子功能）。
③增强子要有启动子才能发挥作用。没有启动子 存在，增强子单独不能表现活性。
④增强子对启动子没有严格的专一性。同一增强
子可以影响不同类型启动子的转录。例如当含有
增强子的病毒基因组整合入宿主细胞基因组时，
能够增强整合区附近宿主某些基因的转录；当增 强子随某些染色体段落移位时，也能提高移到的
新位置周围基因的转录。
Domain B
Domain A
含有重复的-343— -90部分的35S启动子比350bp的35S 启动子的强度大10倍。
•
CaMV 35S 启动子是一个组成型启动子，不仅 可以能在双子叶植物中高效启动基因表达，而且 在许多单子叶植物中也可以高效启动基因表达。 另外 CaMV 35S 启动子内部没有我们常用的酶切 位点，因而容易克隆和使用，在植物基因工程中 得到了广泛的应用。
件。
• 3.增强子（enhancer）
是一种能够提高同一条DNA链上基因转录效率 的顺式调控元件。最早是在SV40病毒中发现的长 约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高 100倍，其后在多种真核生物和原核生物中都发
现了增强子。增强子通常长100－200bp，也和启
动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8－
二、 启动子的类型
1.组成型启动子
• 可以在所有细胞、组织和器官中持续发挥作用的 启动子。如看家基因的启动子。组成型启动子用 来控制基因的持续表达，如抗病、抗虫、抗不良 环境的基因。 • 在植物基因工程中，用于控制基因组成型表达的 启动子主要有2个来源：微生物和植物。
1. 1病毒来源的组成型启动子—CaMV35S 启动子
一、启动子的结构
启动子：位于结构基因5’端上游、能够指导RNA聚合 酶同模板正确结合、启动基因转录的一段DNA序列。
增强子区
启动子区
结构基因
真核启动子比原核更复杂、序列也更长，它不 像原核启动子那样有明显共同一致的序列，而且 单靠RNA聚合酶难以起动转录，而是需要多种蛋 白质因子的相互协调作用。不同真核启动子之间 大小、序列很不相同。不同物种的启动子有时不 能互用，如动物和植物之间。 • 真核启动子中包含了许多调节基因转录的元件， 它们控制着基因表达的强弱或者时空差异。根据 对基因表达的必须性，这些元件分为2类：核心启 动子元件和上游启动子元件
1. 核心启动子元件(ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱore promoter element):
件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。
指RNA
聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和 CAAT盒。核心元
（1） TATA框(TATA box)：位于5′端转录起始点上游约20-30个核苷酸的地 方。TATA框是一个短的核苷酸序列，其碱基顺序为TATAATAA。TATA框是 RNA聚合酶的重要的接触点，它能够使酶准确地识别转录的起始点并开始 转录。当TATA框中的碱基顺序有所改变时，mRNA的转录就会从不正常的 位置开始。 （2） CAAT框(CAAT box)：位于5′端转录起始点上游约70-80个核苷酸的地 方。CAAT框是启动子中另一个短的核苷酸序列， 其碱基顺序为 GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一个结合点，一般认为它控制 着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当这段顺序被改变后，mRNA 的形成量会明显减少。
• CaMV 35S 启动子是花椰菜花叶病毒 （cauliflower mosaic virus，CaMV) 双链 DNA病毒基因组中启动35S RNA基因转录 的启动子， CaMV 35S promoter，它可以 利用宿主细胞核 RNA 聚合酶进行基因转录， 并且不依赖于病毒的产物。
35S启动子的结构
花椰菜花叶病毒35S启动子=CaMV35S启动子
11281 11341 11401 11461 11521 11581 11641 11701 11761 11821 tttcccgcct tcgccgtaaa aaatcttcgt cagtctcaga tcctcggatt gtggctccta ccgacagtgg ttccaaccac acgcacaatc tggagagaac tcagtttagc gactggcgaa caacatggtg agaccaaagg ccattgccca caaatgccat tcccaaagat gtcttcaaag ccactatcct acgggggact ttcatggagt cagttcatac gagcacgaca gcaattgaga gctatctgtc cattgcgata ggacccccac caagtggatt tcgcaagacc cttgac caaagattca agagtctctt cacttgtcta cttttcaaca actttattgt aaggaaaggc ccacgaggag gatgtgatat cttcctctat aatagaggac acgactcaat ctccaaaaat aagggtaata gaagatagtg catcgttgaa catcgtggaa ctccactgac ataaggaagt ctaacagaac gacaagaaga atcaaagata tccggaaacc gaaaaggaag gatgcctctg aaagaagacg gtaagggatg tcatttcatt
NheI(10650)
4. 静止子(silencer)
• 最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗 原受体基因的转录和重排中证实这种负调控顺式 元件的存在。目前对这种在基因转录降低或关闭 中起作用的序列研究还不多，但从已有的例子看 到：静止子的作用可不受序列方向的影响，也能 远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。
茎
叶片横切面
根
花
幼苗
35S 启动子控制的GUS基因在烟草中表达
• 由于CaMV 35S 启动子在植物中成功的应 用，人们也克隆了其它病毒的启动子，如 cassava（木薯） vein mosaic virus (CsVMV) promoter ， Australian banana streak virus (BSV) promoters，mirabilis mosaic virus (MMV) promoter and figwort （玄参）mosaic virus (FMV) promoter，这 些启动子也能够在植物中高效高效启动基 因的转录。