芦丁和槲皮素的化学检识 (2)

实验步骤
• 芦丁和槲皮素的化学检识
(1)对不同强度碱液的溶解度试验：
芦丁
槲皮素
实验步骤
(2)浓硫酸和浓盐酸反应： (3)Molish反应：
实验步骤
(4)盐酸–镁粉试验:
实验步骤
(5)FeCl3反应
实验步骤
(6)AlCl3反应 • 芦丁的紫外吸收光谱测定 • 芦丁提取物含量的测定
实验步骤
• 芦丁的紫外吸收光谱测定： 测定方法：精密称取芦丁l0mg于l00mL量瓶中，加 甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀。从中吸取5mL于 50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度；摇匀备用（ 10µg/mL) A、甲醇光谱：取样品溶液置石英杯中，200~400 nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。 B、甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇 钠溶液3滴后，立即测定。放5分钟后再测一次。 C、AlCl3光谱：在置有样品液的石英杯中加入 AlCl3 溶液6滴，停1分钟后进行测定。然后加入3滴 盐酸(HCl:水=1:1 )再进行测定。
B环有邻二酚羟基 A,B环皆有邻二酚羟基 A,B环皆无邻二酚羟基
实验原理
• 芦丁提取物含量的测定： • 在黄酮类化合物的紫外光谱图上主要有两个吸收带: 环肉桂酰系统引起的吸收带1 ( 300 ) 550nm)和环苯 酰系统引起的吸收带2 ( 240 ) 280nm) 。若加入铝 盐, 则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物,带2 会明显向长波方向移动( 红移) ; 在NaNO2 的强碱 性溶液中, 其在500nm左右吸光度值最大, 从而为分 性溶液中 其在 左右吸光度值最大 光光度法测定提供了可靠的依据 • 注意：用NaNO2 - Al(NO3 ) 3 - NaOH 体系分光光 度法测定总黄酮含量时, 必须严格保证稀释定容用乙 醇的浓度、试剂加入时间、显色时间等测试环节前 后完全一致, 否则会出现很大误差。
标准曲线
0.6 0.5 0.4
吸光度 吸光度Abs
y = 10.46x + 0.014 R² = 0.992
0.3
系列1
0.2 0.1 0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
芦丁标准品浓度mg/ml
线性 (系列1)
实验试剂及仪器
• 试剂：芦丁及槲皮素样品、稀氨水、5%NaHCO3水 溶液、5%Na2CO3水溶液、1%NaOH水溶液、浓 酸、浓硫酸、乙醇、α-萘酚、镁粉、1%FeCl3醇溶 液、1%AlCl3醇溶液、无水甲醇、甲醇钠溶液、 AlCl3无水甲醇溶液、（1：1）盐酸、无水醋酸钠、 硼酸、60%乙醇、30%乙醇、亚硝酸钠溶液（1： 20）、硝酸铝溶液（1：10）、 4%NaOH水溶液、 蒸馏水等 • 仪器：试管若干支、滴管若干个、移液管若干支 （公用）、药匙、100ml、50ml、10ml容量瓶各一 个、紫外分光光度计等
芦丁的鉴别及含量测定
小组成员：陈丽、陈惠渝、 黄雄、李钰川
实验目的
• 熟悉黄酮类化合物的化学检识的常用方法 • 掌握芦丁紫外吸收光谱测定的方法与原理 • 学习用紫外分光光度法测定芦丁提取物的含量
芦丁和槲皮素的化学检识
1.对不同强度碱液的溶解度试验 2.浓硫酸和浓盐酸反应
实验百度文库理
3.Molish反应 4.盐酸-镁粉试验 5.FeCl3反应
4'
7
O
4'
7
O
O
R
R
O
O
O
苯甲酰基
桂皮酰基
黄酮类化合物结构中的交叉共轭
实验原理
芦丁的紫外吸收光谱的测定
多数黄酮类化合物由两个主要吸收带组成： 带I在300-400nm区间，由B环桂皮酰系统的电子跃 迁引起。
O
B
O
B
O
O
实验原理
• 带II在240-285nm区间，由A环苯甲酰系统的电子跃 迁所引起。 。
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6.AlCl3反应
实验原理
• 对不同强度碱液的溶解度试验：
黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性， 可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺 中。由于酚羟基的数目及位置不同，酸性强弱也不 同。以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序依次为： 7,4‘-二OH>7-或4’-OH>一般酚OH>5-OH>3-OH 因此，酚羟基的数目及位置不同的黄酮类化合物酸 性不同，在不同强度碱液中的溶解度也不同。
实验原理
（3）
OH HO O OH HO O O Al3+ HO O OH O OH
AlCl3
OH O O Al O
3+
HCl/H2O
O O Al3+
形成络合物的能力： 黄酮醇3-OH >黄酮5-OH（二氢黄酮5-OH）> 邻二酚羟基 > 二氢黄酮醇5-OH 邻二酚羟基和二氢黄酮醇5-OH在酸性条件下不与AlCl3络合 ； 但不在酸性条件下，五者皆与Al3+络合； 形成络合物越稳定，红移越多。
+NaOMe
∆40-60nm （ε不变或 增强） ∆ 50-60nm （ε下降） 带 I ， II 随 加 NaOMe 时 间延长，逐渐衰减 A环有OH ， 红 移小， 无意义
320-330nm 有吸收，成 苷后消失
+NaOAc (未熔融)
∆5-20
在长波一侧 有明显的肩 峰
+NaOAc (熔融) +NaOAc/ H3BO3 ∆510
220-270
340-390 或340-390(Ia) 300-320(Ib)
370-430(3-4 个小峰) 个小峰
橙酮类
加入诊断试剂后引起的位移及结构测定
加入试剂 样品+甲醇 （黄酮类及 黄酮醇类） 带II 250-285 带I 304-385 说明 两峰强度基本相同，具体位置 与母核上电负性取代基(-OH, OCH3) 有 关 ， -OH, -OCH3 越 多，越长移 有4’-OH，无3-OH 有3-OH，无4’- OH 有3,4’-OH或3,3’,4’-OH（衰减 更快） 7-OH 7-OH
O
A A
O
O
O
实验原理
芦丁的紫外吸收光谱的测定： 芦丁的紫外吸收光谱的测定：
4'
7
O
4'
7
O
O
R
R
O
O
O
苯甲酰基
桂皮酰基
黄酮类化合物结构中的交叉共轭
芦丁的紫外吸收光谱测定
说明： （1）+NaOMe或NaOAc, OH→ONa，变为离子化合物， 共轭系统中的电子云密度增加，红移 另有3,4’-OH或3,3’,4’-OH时，在NaOMe作用下 易氧化破坏，故峰有衰减。 （2）NaOAc为弱碱，仅使酸性较强者，如7,4’-OH解 离。
实验原理
• 浓硫酸和浓盐酸反应：
γ-吡喃环上的1-氧原子，因有未共用的电子对，故 表现微弱的碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸 等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后即可分解。 另外，黄酮类化合物溶于浓硫酸中常常表现出特殊 的颜色，可用于鉴别。
实验原理
• Molish反应：
糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍 生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓 硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。 Molish反应可以鉴定单糖的存在。
（4） 根据只加AlCl3和加入AlCl3及盐酸的紫外 光谱吸收峰位相减的结果，可以判断邻二酚羟 基的取代情况。
带II(240285nm)（苯 （ 甲酰系统） 甲酰系统）
带I(300400nm) 桂皮酰系统 304-350
类 型 黄酮类
说 明 -OH越多，带 越多， 越多 I带II越红移 带 越红移 B环3’,4’有环 有 OH基，带II 基 为双峰（ 为双峰（主 峰伴肩峰） 峰伴肩峰）
∆ 40~65
有4’-OH
∆12-30
有6,7-OH或7,8-OH (5,6-OH无) B环有邻二酚羟基
AlCl3/ HCl
∆60 ∆50-60 ∆35-55 ∆17-20 ∆0 30-40 50-65 0
有3-OH 有3,5-二OH 有5-OH，无3-OH 有6-OR 无3-OH, 5-OH
AlCl3 光 谱 AlCl3/ HCl光谱
实验原理
• 盐酸-镁粉试验：
盐酸-镁粉反应的机制过去解释为由于生 成了花色苷元所致，现在认为是因为生成 了阳碳离子的缘故。
• FeCl3及AlCl3反应：
黄酮类化合物分子中常含有下列结构单元， 故常可与铝盐、铅盐、锆盐、镁盐等试剂 反应，生成有色络合物。
OH O
O
OH
OH O
OH
实验原理
芦丁的紫外吸收光谱的测定： 芦丁的紫外吸收光谱的测定：
328-357 250-285 352-385
黄酮醇类 (3-OR) 黄酮醇类 (3-OH) 异黄酮类 二氢黄酮 （醇） 查耳酮类
245-270 270-295
300-400
B环上有 环上有-OH, 环上有 OCH3对带 对带I 对带 影响不大 查耳酮2’-OH 查耳酮 使带I红移的 使带 红移的 影响最大
实验步骤
• D、醋酸钠光谱；取样品溶液3mL，加入过量的无 水醋酸钠固体，摇匀(杯底剩有少量的醋酸钠，2分 钟内测定，5～10分钟后再测一次。 • E、醋酸钠硼酸光谱： 方法2
实验步骤
• 芦丁提取物的含量测定： • (1)标准曲线的绘制： • (2)测定：精密称取精制芦丁20mg，置l00mL量瓶中 ，加60％乙醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷， 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取25mL，置 50mL量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得 0.1mg/mL的样品液。精密吸取样品液3.0mL置 10mL量瓶中，加30％乙醇使成5mL。精密加亚硝酸 钠溶液(1：20) 0.3mL，摇匀。放置6分钟，再加硝 酸铝溶液(1：10) 0.3mL，摇匀，放置6分钟。加4％ NaOH溶液4mL，用水稀释至刻度，振摇，放置l5分 钟置比色皿中，在500nm波长测定吸收度。从标准 曲线中读出芦丁含量。