第六章 稳定性同位素示踪法

2.N素在不同部位分布的不均匀性
3.分析测定技术所能达到的精度。
15N 示 踪 法 引 入 N 素 肥 料 的 丰 度 计 算
参考公式
af = Wp• Rp• ap/Nf• RN
式中： af：N素肥料的原子百分超 Wp：植物总重量（待测） ap：植物样品中原子百分超 Rp：植物样品中含N百分率
Nf：施纯N量 RN：N肥利用率
A = 2/R’+2 ×100%
或 者 由 质 量 为 28 、 29 、 30 的 峰 值 直 接 算 出 ：
A= [29]+2[30]/2（[28]+[29]+[30])×100%
以下以植物材料实验为例进行计算，
其计算原理也适用于动物等，共同的条件
是在一个相对封闭系统内开展实验。（若
32P等实验，计算时把原子百分超换成 是用
意大利天然硼酸盐
C
12C
捷克扑利兹石灰石
13C
1.108
99.635 0.365 大气中的氮气
N
14N 15N
O
16O
17O 18O
99.759
0.0374 0.2039
大气中的氧气
氮的同位素表
同位素
12N 13N 14N 15N 16N 17N 18N
射线种类 β β β β β
+ +
半衰期 0.011S 9.96m 7.1S 4.15S 0.63S
(Kg/公顷) （8）
(7)
A值：表示土壤有效供应N素量(用A值可以解释 为什么某种土壤适合于种植某种植物)。 (来自：A值/Ndfs=Nf/Ndff)
9、N素回收率： R回 = 已检出的Nf量 / Nf×100% 10、N素损失率： R失 = 100% - R回 (10) (9)
以上公式适用32P等放射性物质（以比强为单位）
注意事项：
1.同位素交换反应：在一定条件下，标记 的铵盐可与大气发生反应：
15NH+
15N丰度高时应注意。
4
14NH 水溶液+
3
14NH+ →
4
15NH 水溶液+
3
14C、 13C、 12C的吸 2.同位素效应：藻类对
收依次递减。
3.予测样品测定项目……
15N原理 五、质谱和光谱测定
14N和15质量不同
仪器分析方法步骤：
1、通电予热仪器10分钟，打开光电倍增管高压。
2、放电管装入燃烧室固定架上。
3、开高频发生器电源，使放电管中样品放电发光。 4、选择适宜放大倍数对 28N、29N、30N峰分别进行 0-2990A0之间扫描。 放大，在2970A
5、放下记录笔，接通扫描开关，划出 28N、 29N、 30N峰高。
八、
13C示踪法
1．样品的制备： （ 1 ） 样 品 碳 转 化 为 BaCO3 ： 干 氧 化 法 （Pregl）: 如上图
B.蒸馏：
用蒸汽蒸馏将消化液中NH3 分离出来， 并测定总N。 方法：消化液中加过量40%NaOH,释放的NH3 被蒸汽逐出，经冷凝后被2%硼酸吸收，加 入混合指示剂用标准硫酸滴定（设置一个 标准液）。 此步骤将NH3-N转变成了NH4+-N（铵态N）， 仪器分析适宜量1mgN/样品2-3ml(浓缩或稀 释)。
一.稳定性同位素示踪法的基本依据：
1.自然界中一种元素同位素组成是相对恒定
2.同一元素的同位素具有相同的化学性质
3.同一元素的同位素之间存在质量差异
重要化学元素的稳定性同位素
元素
H
同位素
1H 2 H(D)
自然丰度
99.985 0.0147
样品来源
新鲜的表面淡水
B
10B 11B
18.46
81.54 98.892
6. 同位素法： ①15N2还原法（Burris,1941）:充15N2密室进行 NdfA=a样/a气×100% 固氮量=NdfA×总N量 ②同位素稀释法（J、O、Legg等，1975），15N施入土壤 NdfA=1-
a /a
固
非
③AN值法（M、Fried等，1975），田间种固N、非固N NdfA=(As + Afix - As) ×NdfF/Af As、Af、Afix分别代表土壤、肥料、大豆有效N量。 NdfF:来自肥料N素的比例。
4.无衰变，实验时间不受限制。
5.可进行放射性示踪法难以进行的实验。
例：N素中T最长的13N：T=9.096m
三. 稳定性同位素分析法的基本流程
同位素引入生物体
动植物原始样品
仪器所需的待测样品 进样过程
质谱分析法
记录
光谱分析法
实验结果分析
四
15N引入丰度的因素 .影响
15N的稀释程度。 1.实验材料对
在生物学和医学中应用”专题讨论会，从此开始
了稳定性核素示踪技术应用的新纪元。
6. 近20年，稳定性核素示踪技术迅速发展，分离分析方 法取得了较大突破，13C、2H、18O、15N广泛应用于生物 学、医学、环保、农药、农学、微生物等研究领域。我 国先后分离了25种元素的100多种稳定性核素，例如：
15N标记化合物就有30余
比强度即可） 2.植样的原子百分超:
ap
ap = A-A自
（2）
（A自= 0.365%或空白实验值）
3.植物从肥料中摄取N的%: Ndff
植物中N有多少%是来自于肥料 （ Percentage of in the plant derived from the fertilizer），可以是根、茎、叶、 果实的任一Ndff
Fra Baidu bibliotek
2.分析样品的制备：
(1) K氏法（Kjeidali）
质谱分析常用法。
A.样品的消化： （例：0.05g植样
+10ml 浓 H2S04+3.3gSe:CuSO4:K2SO4 为 1:10:100混合催化剂→样液清亮再消煮 5h（土）或2h(植)，温度120-140℃。 样品予处理：水杨酸—硫酸法：5g干土 或0.5g植样+12ml水杨酸：硫酸为50g： 1000ml溶液中放置30min，再加2.5g硫 代硫酸钠和15ml水，缓缓加热至停出起 泡→冷却→常规消化）。
15N丰度。 6、求得平均峰高，计算
15N实验结果计算 七．
14、15的质量比28、29、30的小10倍， 不参加运算
当15N丰度小于5%:
R = 质量为28离子流强度/质量为29离 子流强度 此时30N的流子离强度很小， 1.丰度：A = 1/2R+1×100%
(1)
当15N丰度大于5%
R’= 质 量 为 29 离 子 流 强 度 / 质 量 为 30 离 子 流 强 度
Ndff =
ap/af×100%
（设N素来源于土壤
和肥料二方面） （3） af：肥料N的原子百分超（或动物饲料N的原 子百分超，此时又多了一个动物排泄因素）。
上片解释见第五章第37片同位 素稀释法
4 、 植 物 从 土 壤 中 摄 取 N 的 % （ Percentage of in the plant tissue derived from the soil）:Ndfs Ndfs =1- Ndff (4)
质谱：把N2 离子化为 28N-N2 ， 29N-N2 在均匀磁场中发生不同角度偏转 2 光谱：28N-N2：谱线波长为2976.8埃
29N-N
30N-N
，
30N-N
2
使其
2：谱线波长为2982.9埃
2：谱线波长为2988.6埃
-
1800的均匀磁场
加 速 电 压
出口
入口
六.供仪器待测样品的制备、测量
第六章
稳定性同位素示踪法
概述：
20Ne 1、1912年，Thomson首发现稳定性核素
和22Ne（氖）。 2、1929年，Naude发现了15N。 3、1937年，Urey等首次报道人工生产 15N的 方法。 4、1940年，先后获得具生物意义的15N、18O 和3H大量生产。
5. 1947年9月在美国Wisconsin大学召开了“同位素
15N示踪与生物固氮(以下各方法简讲)
工业固氮（Haber-Bosch反应）：N2+3H2 剂/45℃，200在气压 2NH3
催化
生 物 固 氮 ： N2 2NH3+xADP+xPi
++xATP +6H
-/ 6e
固 氮 酶
下列研究方法： 1. 测根瘤数目和干物质产量。早、有无？ 2. 氮素平衡法。十分烦琐。 3. 比较固N作物和非固N作物总N量差异。 4. 乙炔还原法。简单、灵敏。 5.乙炔还原成乙烯，存在转换因子（3个）。
5、植物中来自肥料的N量: Npf
Npf=植物总N量×ap/af （5）
Npf+Nps=植物中总N量（已在定N中测定, K氏定N法）設总N来源于土壤和肥料，则：
6.植物中来自土壤N的量：Nps
Nps = 总N - Npf (6)
7.N素利用率：R = Npf / Nf×100% Nf：施入纯N的总量 8.土壤A值：A值 =Ndfs / Ndff×Nf
B．冷却至室温后在光谱仪上测定 纯样品火焰为粉红色或淡黄色 有CO2呈白色，有水呈黄色）
注意：
如果是液体样品。需用Pyrex玻 璃管（1cm Φ 2mm）吸满样液，烘 干后再放入放电管。
CuO 、 CaO 使 用 前 用 700℃ 高 温 烘 干 除 去 CO2 ， H2O ， 并 在 122 压力下制成棒状,备光谱 18Kg/cm 分析
自然丰度
99.635 0.365
稳定性同位素标记物的命名
1978年国际纯化学和化学联合会IUPAC的命名 法: 1. 结构式: 15[N]HCl 物质不存在) 或15NHCl（这样純的
2. 单标记化合物: H215N-CO-NH2 15N-尿素， 15N的丰度可为5%，10%，15%…… 例如 3. 双标记化合物(一个同位素): H215N-CO-15NH2 尿素 4. 混合标记化合物: 尿素 ( 15NH2)13CO (13C15N)
等计算。
练习题：
蕃茄实验地中施用15N-尿素纯N20Kg/亩，收获后测得植物含N 量为30Kg/亩，植物样品的15N丰度为0.67%，15N-尿素的15N丰度为1.37%， 设自然丰度为0.37%，尿素的含N量为40%。
求：1、每亩施入尿素量？2、肥料N素的利用率？ 3.A值? 解：∵ ap = 0.67-0.37 = 0.3% af = 1.37-0.37 = 1.0%
种。
几个概念
稳定性同位素（Stable isotope） 丰度（Abundance） A 即某核在该组同位素中浓度(通常指人工加浓 了 的)。 自然丰度（Natural abundaa） A自(AO) 15N：0.365%、18O:0.204% 原子百分超（Atom percent excess） a a = A-A自 又称富集度（Enrichment） 富集15N（Enriched15N） 贫化15N（Depeled15N )
核素
14N
15N
A（%）
质量数
99.635
0.365
14
15
注意：由于同位素之间的质量差异，因此 它们的物理、化学、生物化学等性质会有 所不同，进行实验时，需注意同位素效应。
二. 稳定性同位素示踪法的特点：
1.无放射性，无辐射效应及不良影响。 2.安全、对人无伤害。
3.无污染，不受环境条件限制。
∴
Ndff = ap/af = 0.3/1.0 = 30%
Npf = Np×Ndff = 30Kg/亩×30% = 9Kg/亩
施入尿素量：W = 20/40% = 80Kg/亩 肥料N素利用率：R = Npf/Nf= 9/20 = 45% A值=Ndfs/Ndff×Nf=70%/30% ×20Kg/亩=46.7Kg/亩（土壤中可 供蕃茄生长的每亩有效N--当然不是全部被吸收,A值愈大说明土 壤的供N能力愈强）
以下在光谱仪上进行,可用液体样
品也可用干样品
(2).杜马法（Dumas）
—光谱分析中常用法
适用于含N量低（少于100 μg） 的样品，光谱测量。
方法：
A．在放电管中装入样品，氧化剂（CuO） 及吸收剂（CaO）抽真空，抽完后熔封放 电管。
在马福炉中燃烧0.5-3h（560℃）样品， （CaO吸收CO2和H2O)以产生N2气。
1.对待测样品的要求：
(1) 因为测量的是不同质量离子流的相对含 量，因此，保证有一定的N量即可。一般要求 含N量1mg/ml最少不低于0.5mg。 (2) 仪器的本底检查。 (3)离子峰的选择（14N和15N的峰比28N、29N小 10倍，选28N、29N、30N）。 (4) 仪器精确度检查（检查去O2 后的空气或 纯N气）。
以下在质谱仪上进行
C.将NH4
+-N转化为N
气 : 2
在真空条件下，将上述样品与次溴酸钠 反应，放出N气（在质谱仪内进行）详
见书15N章节。
制样时注意：
1.所有试剂纯度要高。 2.消化要完全。
3.防止样品间交叉污染（每个样品 蒸馏前用蒸馏15ml乙醇洗器皿）。 4.“Y”型管及内部反应抽气须彻底， 防其它气体干扰。