慢病毒载体的设计及应用进展

７２中国生物工程杂志Ｃｈｉｎａ

ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶ０１．２６Ｎｏ．１１２００６

表达时间¨４｜。这些调控元件的发现为构建慢病毒载体，使目的基因在靶细胞中持续高效表达提供了依据。２．３提高转入基因的转录靶向性

病毒载体携带的外源基因转入宿主细胞后是否能够表达还与启动外源基因的启动子及宿主细胞的类型均有关系，一般类型的慢病毒载体都选用管家基因的启动子来启动外源基因以保证其有效转录。研究者由此想到了应用靶细胞特异性表达基因的启动子作为载体外源基因的启动序列，从而使转入的外源基因只在特定类型的细胞中表达。有研究报道，利用星形胶质细胞的特异性表达蛋白ＧＦＡＰ的启动子构建的慢病毒载体在注入动物模型的受损脑区后，其携带的外源基因特异性地在星形胶质细胞中表达，并且外源基因的表达水平可以伴随内源性ＧＦＡＰ基因的激活而得到调节¨５｜。这一技术也被应用于生产不同组织特异性表达ＧＦＰ的转基因动物，其方法是利用含不同组织特异表达蛋白启动子的慢病毒载体转染胚胎细胞，如果胚胎发育成功，特定的组织细胞会呈ＧＦＰ阳性。应用组织特异性的启动子和增强子来驱动慢病毒载体中的外源基因能够使其在特定的组织细胞中表达，这一进展为慢病毒载体介导的基因靶向性治疗提供了理论基础。

２．４加入可对外源基因进行转录调节的调控元件如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节也是保证基因治疗的有效性和安全性的重要问题。目前应用最多、前景最好的是四环素调节系统，即ｔｅｔ－ｏｎ及ｔｅｔ－ｏｆｆ系统。这一系统是根据大肠埃希氏菌属ＴＮｌ０的四环素抗性操纵子的结构特点构建的，这一抗性操纵子包含一个四环素抑制蛋白（ＴｅｔＲ）、一个特异性的ＤＮＡ结合位点及四环素操纵序列（ＴｅｔＯ）。无四环素存在的条件下，ＴｅｔＲ呈二聚体状态并与ＴｅｔＯ结合。四环素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）或四环素类似物——强力霉素（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）可以与ＴｅｔＲ结合使其构象发生改变，从而导致ＴｅｔＲ与ＴｅｔＯ分离。后来发现，ＴｅｔＲ存在一种突变体结构，在这种突变体中决定ＴｅｔＲ空间构象的四个核心蛋白发生了突变，形成了一种反式的空间构象，即当ｄｏｘ存在时，ＴｅｔＲ呈二聚体结构结合于ＴｅｔＯ上阻碍了下游基因的转录。利用四环素原核操纵将单纯疱疹病毒的转录激活域（ＶＰｌ６）与ＴｅｔＲ或ＴｅｔＲ的突变体融合分别组成四环素反式激活因子（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｔＴＡ）和ｒｔＴＡ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）１．１６Ｊ。为了在哺乳

动物细胞中表达，研究者将ＣＭＶ启动子与ＴｅｔＯ重复序列融和，与ｔＴＡ结合构成了Ｔｅｔ．ｏｆｆ转录调节系统，与ｒｔＴＡ结合构成了ｔｅｔ－ｏｎ转录调节系统。由于ｔｅｔ．０ｆｆ系统需要长期给予强力霉素来维持外源基因的表达，这对于终身的基因治疗不是一个理想的选择。同时，ｔｅｔ．ｏｆｆ系统的诱导启动需要通过药理作用清除强力霉素，这一过程较ｔｅｔ－ｏｎ系统的诱导过程要缓慢。因此，ｔｅｔ．ｏｎ转录调节系统在目前基因治疗领域的应用更为广泛［１７ｌ。

图３四环素操纵子ｔｅｔ－ｏｎ和ｔｅｔ－ｏｆｆ结构模式图

Ｆｉｇ．３Ｐｉｃｔｕｒｅｏｆｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｏｎａｎｄｏｆｆｓｙｓｔｅｍ

目前应用的Ｔｅｔ－ｏｎ基因调节系统多分别构建于两个质粒中，其中一个含有由外源启动子驱动的ｒｔＴＡ，另一个质粒中含有ＴＲＥ及受其调控的外源基因。二者通过共同转染同一细胞来发挥ＴＲＥ和ｒｔＴＡ问的调控作用，这一过程需要通过两步筛选来完成，即首先筛选出成功转染ＴＲＥ的细胞群，再用含ｒｔＴＡ的质粒来转染ＴＲＥ阳性的细胞群，然后通过第二次的分筛筛选出二者都转染成功的细胞群。这一系统更适合于体外的实验，在在体实验中的可控性较差。有研究者正试图将二者构建于同一载体中。但是，Ｔｅｔ－ｏｎ系统不足之处在于背景效应的存在，所谓背景效应是指在四环素不存在的情况下，ｒｔＴＡ也会与ＴｅｔＯ结合，这种情况会导致受其调控的蛋白表达量的下降，这对于在低剂量水平发挥作用的蛋白表达更为不利，如生长因子类蛋白。针对这一问题，有些实验室正对ｒｔＴＡ作进一步的改进，如经过改建后的反式转录激活因子ｒｔＴＡ２ｓ．Ｍ２６，经过ＴｅｔＲ区的突变和遗传密码的优势选择，以及ＶＰｌ６区的激活域改建为含１２个氨基酸的重复序列，其特异性、稳定性、可调性都得到了很大提高。它可以在四环素浓度较最初的ｒｔＴＡ低１０倍的情况下发挥作用，在四环素不存在的情况下，没有背景效应的产生。并且外源基因的表达水平与四环素的浓度在一定范围内呈剂量依赖关系，即随着外源给予四环素浓度的增加，外源基因的表达量也会相应增加【ｌ

８｜。因此，通过对ｒｔＴＡ的改

慢病毒载体的设计及应用进展

作者：王淑艳， 张愚， WANG Shu-yan， ZHANG Yu

作者单位：教育部神经变性病学重点实验室,首都医科大学宣武医院细胞治疗中心,北京,100053

刊名：

中国生物工程杂志

英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY

年，卷(期)：2006,26(11)

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