土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定

土壤中拮抗放线菌的筛选与鉴定

一、培养基

1 放线菌培养基

高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，NaCl 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。

黄豆粉固体培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，过滤保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl 2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，琼脂15g，H2O 1000mL，初始pH7.0。

放线菌发酵培养基：大豆粉20g（沸水煮30min，纱布过滤后保留滤液），蔗糖10g，可溶性淀粉5g，蛋白胨2g，酵母膏2g，NaCl2g，CaCO31g，MgSO4·7H2O 0.5g，KH2PO40.5g，H2O 1000mL，初始pH7.0。

2 放线菌形态及培养特征研究用培养基

察氏培养基（ISP1）：蔗糖30g，NaNO32.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，H2O 1000mL，pH 7.2～7.4。

麦芽膏－酵母膏培养基(ISP2)：酵母膏4.0g，葡萄糖4.0g，麦芽膏10.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。

燕麦片培养基（ISP3）：燕麦片20g（加1000mL 水煮20 分钟，然后用离心或过滤得澄清滤液并补足1000mL），微量盐溶液1mL，pH 7.2（微量盐溶液：FeSO4.7H2O 0.1g，MnCl2.4H2O 0.1g，ZnSO4.7H2O 0.1g，H2O 100mL）。

甘油-天门冬酰胺培养基（ISP5）：L-天门冬酰胺1.0g，甘油10.0g，K2HPO41g，微量盐溶液1mL，琼脂20g，pH 7.0～7.4。

无机盐淀粉培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，CaCO32.0g，(NH4)2SO42.0g，微量盐溶液1mL，H2O 1000mL，pH 7.4。

马铃薯培养基：去皮马铃薯块200g（1000 毫升水，80℃煮１小时，然后离心或过滤得上清液），葡萄糖20g，pH 7.4。

营养琼脂培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5.0g，H2O 1000mL，pH 7.4（亦可补加葡萄糖10g）。

葡萄糖-天门冬酰胺培养基：葡萄糖10g，L-天门冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，牛肉膏2g，H2O 1000mL，pH 7.2。

3 测定生理生化特性供试培养基

淀粉水解测定培养基：可溶性淀粉10g，K2HPO45.65g，NaCl 0.5g，KNO31g，MgCO31g，琼脂15g，H2O 1000mL，pH 7.2~7.4。

纤维素水解培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，H2O1000mL。滤纸条（5cm×0.8cm）灭菌20 分钟。（pH7.0～7.2）

明胶液化培养基：蛋白胨5g，葡萄糖20g，明胶200g，H2O 1000mL，明胶灭菌10min，pH7.0（灭菌3 次，每次20min，灭菌后立即浸入冷水中冷却。）

牛奶凝固与胨化培养基：脱脂牛奶1000mL，CaCO30.02g，pH 7.2~7.4，间歇灭菌三次（脱脂牛奶的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min）脱脂，除去上层油脂，即得脱脂牛奶）。

石蕊溶液配制：称取2.5g 石蕊浸泡在100ml 蒸馏水中过夜，使石蕊充分溶解，然后过滤备用。石蕊牛奶的制备：2.5％的石蕊液与脱脂牛奶以4：100（V/V）比例混合，牛奶呈紫丁香色，分装于试管中，灭菌备用。接种前抽检灭菌是否彻底。

硫化氢产生测试培养基（柴斯钠培养基）：蛋白胨10g，柠檬酸铁0.5g，K2HPO41g，琼脂15g ，H2O 1000mL，pH 7.2。

黑色素产生培养基：酪氨酸（L-Tyr）1g，酵母膏1g，NaCl 8.5g，琼脂20g，H2O1000mL，pH 7.2。

硝酸盐还原试验培养基：MgSO4.7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，KNO31g，NaCl

0.5g，H2O 1000mL，A 溶液：对氨基苯磺酸0.5g，醋酸（80％醋酸，加2 倍水稀释）150mL；

B 溶液：二苯胺0.1g，H2O 20mL)

二苯胺试剂（二苯胺0.5 g 溶于100 mL 浓硫酸中，用20 mL 蒸馏水稀释）

碳源利用培养基：（NH4）2SO4 2.64g，KH2PO4 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgS04.7H2O 0.5g，CuSO4.5H2O 0.0064g，FeSO4.7H2O 0.0011g，MnC12.4H2O 0.0079g，ZnsO4.7H2O 0.00l5g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。

二、实验操作步骤

1拮抗菌的形态鉴定

1）菌株形态学特征观察

采用插片法，将菌株接种到高氏一号培养基（固体培养基）中盖玻片与培养基的内侧交界线上，置于28℃培养7、14、28 d。用无菌镊子小心取出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在洁净载玻片上直接镜检。

2）菌株的培养特征观察

将菌株接种到察氏琼脂、葡萄糖-天门冬素琼脂、酵母膏-麦牙浸膏琼脂(ISP2)、燕麦片琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂(ISP4)、甘油-天门冬素琼脂（ISP5）、马玲薯琼脂，置于28℃培养，分别在7、14、28 d 后观察其孢子链、气生菌丝体颜色（即孢子链未形成前的颜色）、基质菌丝体的颜色和是否产生可溶性色素。取成熟期的颜色特征为其培养特征，作为定种的依据。

2 菌株的生理生化特性的测定

1）明胶液化试验

在明胶培养基表面(斜面)接种鉴定菌，28℃下培养30d，在第5、10、20、30d各观察一次。观察前放入冰箱冷却20分钟。以液化时间的早晚及程度为依据，确定液化的快慢和强弱。每个菌株3次重复。

2）淀粉酶的测定

将菌种接种于淀粉培养基平板上，采用点接法，培养10天或20天后往培养基表面倒入碘液，如有淀粉酶产生，即将淀粉变成糊精或利用吸收，遇到碘液不变成蓝色，却形成透明圈;圈的大小表示淀粉酶产生的强弱。如不产生淀粉酶，则菌落周围部位遇碘时呈蓝色。3）硝酸盐还原

将待测菌接种于硝酸盐液体培养基中，置28℃培养箱中培养7d，14d。以不接种作空白培养液对照。在干净的空试管或白色盘中倒入少许培养液，再各加1滴A液和B液，在对照管中同样加入A、B液各1滴。当培养液中滴入A，B液后，若溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等，表示有亚硝酸盐存在，硝酸盐反应阳性。如无红色出现，则可加入1-2滴二苯胺试剂，此时如果成蓝色，则表示培养液中仍有硝酸盐存在而无亚硝酸盐反应，则还原作用为阴性。若不成蓝色，表示硝酸盐和新形成的亚硝酸盐都己还原成其它物质，仍按阳性对待。该反应是在较为厌氧的条件下进行的，所以分装培养液时液面易高些。由于亚硝酸盐可以是硝酸盐还原最终产物，也可以是整个还原过程的中间产物，而且各种菌还原速度相差较大，所以培养18~24h的第一次观察应及时。

4）牛奶石蕊试验