全基因组重测序数据分析详细说明

全基因组重测序数据分析

1. 简介(Introduction)

通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。

实验设计与样本

（1）Case-Control 对照组设计；

（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；

初级数据分析

1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。

2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。

3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。

4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。

5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、

缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。

高级数据分析

1.测序短序列匹配（Read Mapping）

（1）屏蔽掉Y染色体上假体染色体区域（pseudo-autosomal region）, 将Read与参考序列NCBI36进行匹配（包括所有染色体，未定位的contig，以及线粒体序列mtDNA（将用校正的剑桥参考序列做替代）)。采用标准序列匹配处理对原始序列文件进行基因组匹配，将Read与参考基因组进行初始匹配；给出匹配的平均质量得分分布；

（2）碱基质量得分的校准。我们采用碱基质量校准算法对每个Read中每个碱基的质量进行评分，并校准一些显著性误差，包括来自测序循环和双核苷酸结构导致的误差。

（3）测序误差率估计。pseudoautosomal contigs，short repeat regions（包括segmental duplication，simple repeat sequence-通过tandem repeat识别算法识别）将被过滤；

2. SNP Calling 计算（SNP Calling）

我们可以采用整合多种SNP探测算法的结果，综合地，更准确地识别出SNP。通过对多种算法各自识别的SNP进行一致性分析，保留具有高度一致性的SNP作为最终SNP结果。这些具有高度一致性的SNP同时具有非常高的可信度。在分析中使用到的SNP识别算法包括基于贝叶斯和基因型似然值计算的方法，以及使用连锁不平衡LD或推断技术用于优化SNP识别检出的准确性。

统计SNV的等位基因频率在全基因组上的分布

稀有等位基因数目在不同类别的SNV中的比率分布（a）；SNV的类别主要考虑：（1）无义（nonsense）,（2）化学结构中非同义，（3）所有非同义，（4）保守的非同义，（5）非编码，（6）同义，等类型SNV；另外，针对保守性的讨论，我们将分析非编码区域SNV 的保守型情况及其分布（图a, b）

3. 短插入/缺失探测（Short Insertion /Deletion （Indel）Call）

(1). 计算全基因组的indel变异和基因型检出值的过程

计算过程主要包含3步：（1）潜在的indel的探测；（2）通过局部重匹配计算基因型的似然值；（3）基于LD连锁不平衡的基因型推断和检出识别。Indel在X，Y染色体上没有检出值得出。

(2). Indel 过滤处理

4. 融合基因的发现（Fusion gene Discovery）

选择注释的基因信息来自于当前最新版本的Ensemble Gene数据库，RefSeq数据库和Vega Gene数据库。下面图例给出的是融合基因的形成，即来自不同染色体的各自外显子经过重组形成融合基因的模式图。

5. 结构变异（Structure Variation）

结构变异（Structure Variation－SV）是基因组变异的一类主要来源，主要由大片段序列（一般>1kb）的拷贝数变异（copy number variation, CNV）以及非平衡倒位（unbalance inversion）事件构成。目前主要一些基因组研究探测识别的SV大约有20,000个（DGV数据库）。在某些区域上，甚至SV形成的速率要大于SNP的速率，并与疾病临床表型具有很大关联。我们不仅可以通过测序方式识别公共的SV，也可以识别全新的SV。全新的SV的生成一般在germ line和突变机制方面都具有所报道。然而，当前对SV的精确解析需要更好的算法实现。同时，我们也需要对SV的形成机制要有更重要的认知，尤其是SV否起始于祖先基因组座位的插入或缺失，而不简单的根据等位基因频率或则与参考基因组序列比对判断。SV的功能性也结合群体遗传学和进化生物学结合起来，我们综合的考察SV的形成机制类别。

SV形成机制分析，包括以下几种可能存在的主要机制的识别发现：

（A）同源性介导的直系同源序列区段重组（NAHR）；

（B）与DNA双链断裂修复或复制叉停顿修复相关的非同源重组（NHR）；

（C）通过扩展和压缩机制形成可变数量的串联重复序列（VNTR）；

（D）转座元件插入（一般主要是长／短间隔序列元件LINE/SINE或者伴随TEI相关事件的两者的组合）。

结构变异探测和扩增子（Amplicon）的探测与识别分析:如下图所示