植物病原原核生物及其所致病害

一、植物病原原核生物及其所致病害
一、目的和要求
掌握植物细菌病害的分类鉴定需要特有的实验技术，熟悉植物细菌病害症状类型和病原细菌的基本形态，学习植物细菌病害简易诊断方法及病原细菌初步鉴定的程序和技术，为以后植物细菌病害的正确诊断和病原细菌的分类鉴定打下基础。

二、材料和用具
原核生物引起病害的标本、照片或新鲜材料。

三、病原物分离与鉴定
1. 用刀片或剪刀从植物病组织上取下1平方厘米大小叶片，
2.先经无菌水漂洗两遍，再用75%酒精消毒1.5 分钟后，再用无菌水漂洗两遍。

3.将清洗好的叶片用枪头捣碎后悬浮于1mL的无菌水中。

4.菌悬液稀释合适的倍数，用涂布棒涂布于含有适当抗生素的NA平板上；或者用接种环在培养基上划线，
5. 28℃培养2-3天后，观察平板上单菌落生长情况。

二、植物病原生物基因组DNA提取
1. 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Eppendorf管中，13000rpm离心1min, 弃上清液，收集菌体。

2. 加入567ul TE缓冲液重新悬浮沉淀，加入30ul 10% SDS，混合。

置于37℃水浴1h。

3. 加入5M NaCl，完全混合，再加入80 ul CTAB/ NaCl溶液，混合。

在65℃下保温10分钟。

4. 加入等体积氯仿，剧烈混合。

8000rpm离心5min，小心吸取上清液，用氯仿抽提2次，至界面无白色沉淀物。

5. 加两倍体积无水乙醇，室温放置15分钟，10，000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4℃保存备用。