NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子

NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子
NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子，目前关于致癌物质的研究比较多，但关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。

PIKARSKY应用the Mdr2-knockout mouse（自发性胆汁郁积致肝癌模型），发现肝内皮细胞和炎细胞通过上调肿瘤坏死因子引发NF-kB，NF-kB与肿瘤形成密切相关，提示NF-kB 是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子，可能为慢性炎症所致肿瘤的预防提供可能的靶点。

我们还不清楚人类癌症的起因，但是，可以估计到，致癌物质的检测和慢性炎症是肿瘤发展的两个潜在条件，慢性炎症能够解释约20%的人类癌症1。

因此，致癌物质的检测和癌症之间的因果关系已被广泛研究2。

关于慢性炎症所致肿瘤发生的分子细胞机理仍不十分清楚。

我们知道，在肿瘤中检常能测到核因子kB (NF-kB)（一种炎症反应的标志因子）的活性4,5，它可能是一种炎症和肿瘤的过度环节。

为了验证这一假设，我们研究了敲除Mdr2基因的小鼠品系，能够通过肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎6，它是一种炎症与癌症相关的典型例子7。

我们观察了敲除Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进，结果显示，在邻近的内皮和炎症细胞中，随着肿瘤坏死因子的上升，炎症过程能够触发肝细胞中的NF-kB因子。

在七个月鼠龄的小鼠中，通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物IkB，来阻断NF-kB，这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。

作为对照，通过抗肿瘤坏死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段，使用具有IkB的超级抑制物进行诱导，来抑制NF - kB的作用，导致转化的肝细胞发生细胞凋亡，破坏肝细胞癌的进展。

因此，我们的研究表明，NF –kB能促进炎症相关的癌症，因此，是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。

肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因，通常是在慢性炎症的基础上发生8。

根据在敲除Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展，我们已经证实了前期已开展实验的结果6，9，这和人类的肝癌非常相似，包括以下几个不同时期：炎症，异型增生，不典型增生结节（腺瘤样），癌转移（附图1a，b）。

在敲除Mdr2基因小鼠中，肝炎是疾病的最早迹象，其特点是广泛的导管和汇管混合炎性浸润，在CD3阳性细胞中最丰富（附图1C）。

NF-kB 的活性常在人类肝癌中被检测到，尤其是在肝炎中8。

根据RelA (p65)免疫染色，NF-kB 的活性可能与敲除了Mdr2的肝癌形成有关(Fig. 1a)。

细胞核染色表明，NF-kB 的活性在基因敲除小鼠的所有年龄中都很明显。

但在正常、年龄匹配的小鼠，这促使研究NF- kB活性在基因敲除小鼠的来源。

在一些肿瘤，如霍奇金病和某些淋巴瘤，NF - kB的活化具有一种内在的，肿瘤自发的特点，可能与它的信号通路中的突变有关10。

如果类似机制发生在Mdr2敲除的肝癌，在所有肿瘤的肝细胞中，人们会观察核NF- kB发生活化。

然而，这并非如此; NF - kB的活化在实质中是分散的，主要是靠近有炎症的肝门（图1e中，左图），这意味着一个炎症引起的现象。

为了评估这种可能性，我们给基因敲除和野生型小鼠饲喂非甾体抗炎药（NSAID）布洛芬10天。

通过组织学分析（图1b），这种治疗方法能明显导致炎症减少，显着降低血清谷丙转氨酶（ALT），一种肝细胞损伤标志物（图1C）及中性粒细胞减少（图1C，D）。

p65的免疫染色结果表明，在类固醇消炎药治疗组的肝细胞NF - kB的活化程度明显低于对照组。

与此相反，在腹腔内的肿瘤坏死因子作用下，布洛芬并没有对肝细胞NF – kB活性产生影响（数据未显示）。

因此，在基因敲除肝细胞中，似乎由炎症细胞引起的NF – kB活性对实质浸润是次要的。

在肝炎中，TNFa是一种类似NF-kB活性的介质，特别是它对细胞膜形成的作用，在基因敲除的肝脏中，属于正调节(Fig. 2a)。

为了研究这一可能性，我们用具有中和作用的抗-TNFa抗体处理基因敲除的小鼠三天，然后进行分析肝细胞中NF-kB的活性。

抗肿瘤坏死因子的治疗能消除肝细胞p65的核染色（图2b），进一步确定了NF - kB的活化主要由TNFa诱导的预测。

要确定肝炎中肿瘤坏死因子的来源，我们把肝细胞分为野生型和基因敲除型（80％苏木纯度和-曙红（H＆E 染色））及其他细胞（2％肝细胞）。

通过实时定量PCR分析TNFa表达的两种成分，已经确定TNFa的主要来源于无肝细胞部分，基因敲除型小鼠比野生型小鼠
的细胞和NF-kB活性间的关系，肝切片分别。

TNFa表达主要在肝门静脉处被检测到，包括内皮和炎症细胞(Fig. 2d)。

由p65 染色的肝细胞核主要位于TNFa阳性的肝门静脉处(Fig. 2f),这表明肝细胞NF-kB主要经TNFa旁分泌的刺激引起活化。

为了验证TNFa的产生者并能区分他们哪些是来自结合TNFa的细胞，野生型的肝切片和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠肝切片分别通过mRNA的原位杂交进行分析。

和免疫染色的数据非常相似，在基因敲除小鼠的内皮和炎症细胞中，我们发现TNFa mRNA呈过高表达状态，野生型和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠则很少表达。

在基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝细胞中，几乎检测不到TNFa的表达(Fig. 2e).
在基因敲除的肝细胞中，我们经常能检测到NF-kB的活性，这表明炎症相关的NF-kB活性能够促进肿瘤的生长4,5。

为了能直接评估NF-kB在肝癌形成中的作用，我们用携带了两个转录基因的D N-I k Bhep小鼠繁殖了Mdr2基因敲除的小鼠：一个是由调节四环素的启动子控制的非降解D N-I k B，另一个是由特异性肝细胞C/EBPb启动子(TALAP1)11控制的四环素反转录因子。

调节四环素的启动子也指导荧光素酶的表达，所以，可以用具有活性的小鼠荧光素酶11来检测转基因表达水平和组织特异性。

根据具有Mdr2基因敲除的双转基因的DN - IkBhep小鼠与Mdr2敲除小鼠产生Mdr22 / 2的DN - IkBhep（双突变）小鼠服从NF - kB的调节。

将来自具有抗荧光素酶抗体的相同的动物的肝脏进行免疫组织化学染色，结果表明，只有肝细胞表达转基因，而不是胆管上皮细胞，(Supplementary Fig. 2a)。

和预测的一样，在基因敲除小鼠和用多西环素(抑制转基因)处理的小鼠中，p65 免疫染色检测到许多阳性的肝细胞核, 但在未经处理的双突变小鼠中则没有检测到(Supplementary Fig. 2b, c)。

在基因敲除小鼠和双突变小鼠（不分多Dox（多西环素））(结果未显示)染色呈阳性的胆道细胞和Kupffer cells 都能被检测到，证明转基因在抑制NF-kB活性方面具有特异性和有效性。

因为，在敲除Mdr2小鼠中，肝炎起始于胆道系统6，它不应该受到特异性肝细胞D N-I k Bhep的影响。

然而，在评估NF-kB在肿瘤形成中的作用之前, 我们想要排除在炎症形成过程中任何可能抑制NF-kB 的可能性因素。

与那些年龄匹配的野生型小鼠相比，基因敲除小鼠和双突变小鼠都有较高的ALT水平(Fig. 3b)。

将各组所有年龄的小鼠肝脏进行组织学分析，结果显示，和非化脓性胆管炎类似，肝门静脉扩张是由于胆管增生，一种混合性的肝门静脉炎性浸润和轻度至中度纤维化(Fig. 3a)。

在肝门束和肝实质。

这两个品系具有大量的阳性CD3和阳性髓过氧化物酶（MPO）细胞。

因此，好像Mdr2敲除小鼠的基本炎症过程主要维持在双突变小鼠，与肝细胞的NF - kB活性无关。

Mdr2敲除肝细胞和野生型的区分主要依据几个异常功能：高增殖率，高染色体倍数和异常增生。

而第一点也是肝损伤和部分肝切除的特点12，异型增生
是恶化前的条件13。

肝细胞增殖由溴脱氧尿苷（BrdU）标记和Ki - 67抗原染色进行测定。

与野生型小鼠相比，这两种标记在基因敲除和双突变小鼠中明显增强（图3b）。

与以往研究的相同点14，15，NF - kB的缺乏不会导致肝细胞增殖：在任何年龄的基因敲除和双突变小鼠中，无论BrdU标记还是Ki - 67染色都没有明显的差别。

肝细胞异常增生有两大特点，组织破坏和细胞学异型性。

组织学分析显示，在基因敲除和双突变小鼠中，红细胞大小不均是一个显著特点，在所有动物品系中，4个月时，异常增生非常明显，7个月后，异常增生会明显增加。

在基因敲除和双突变小鼠任何年龄组之间，我们还不能检测到异常增生的宽度或深度(Fig. 3c)。

以年龄相匹配的野生型小鼠作为对照，我们尝试量化分析肝细胞癌前变化，并分析两个品系的肝细胞染色体倍数。

从肝脏中分离的细胞核用碘化丙叮进行染色，用荧光活化细胞分选系统(FACS)检测。

两组都有高程度的染色体倍数，我们注意到，在4或7个月的基因敲除和双突变小鼠中，细胞周期增殖之间没有显着性差异（图3b）。

发现基因敲除和双突变小鼠显示差不多的增殖程度，高倍染色体和异常增生暗示NF-kB在肿瘤形成的早期不是必须的。

然而，NF - kB的抑制物对肿瘤早期阶段并没有影响，大龄小鼠的磁共振成像(MRI)和组织学分析能清晰地辨认出基因敲除小鼠、经Dox处理的小鼠和未经处理的双突变小鼠（(NF-kB缺乏）。

在10个月，60％和78%的基因敲除小鼠和经Dox处理的小鼠分别有肝癌，而只有10％未经处理的双突变小鼠发生肝癌(P＜0.01, Fig. 4)。

因此，消除肝细胞中NF-kB 的活性能减少肿瘤的发生。

当比较这两个小鼠组的每只小鼠的肿瘤数量的平均值时，在NF - kB缺乏动物中的类似的肿瘤抑制作用引起了人们的注意（数据未所示）。

在肿瘤的发展哪个阶段，NF - kB的抑制物能发挥它的抗肿瘤效果呢？到第7个月，在基因敲除和双突变小鼠的肿瘤发生早期仍没有观察到差别：两组都没有探测到肿瘤，仅有一些发育不良的实质。

因此，在第7个月，我们去除转基因，恢复肝细胞中NF-kB的活性。

使用MRI检测肿瘤发展，进行3个月。

令人惊讶的是，在这三个月期间，饲喂Dox (NF-kB proficient)的9只小鼠，有7只能够用MRI 探测到肿瘤。

在适当的鼠龄，来自基因敲除的这些肿瘤都不能区分大小(Fig. 4b)及组织学外观（数据未显示）。

因此，似乎NF – kB在癌前病变的早期阶段可有可无（即肿瘤开始），但这对肿瘤的后期发展有必要。

11和基有必要作用。

总的来说，在双突变小鼠中，NF-kB的抗细胞凋亡的作用能促进IkB超级抑制物的抑制肿瘤效应。

为了研究这一可能性，我们对有活性的半胱天冬酶-3使用免疫染色来评估细胞凋亡。

在第7个月，与野生型肝脏相比，基因敲除的肝脏（其中有大部分肝细胞是发育不良的; Fig. 3c）显示更多的细胞凋亡，可能是由于炎症的毒性效应(Fig. 5a)。

然而，阻断肝细胞中的NF – kB，结果能诱导三倍多的肝细胞凋亡。

值得注意的是，通过抗肿瘤坏死因子的治疗，能达到一个类似的效是。

两者合计，我们的结果表明，NF - kB的抑制物通过促进已转化的肝细胞发生凋亡来发挥其肿瘤抑制效应。

NF - kB调节多种抗凋亡基因，其中一些可能与肝细胞转化有关。

为了确定有关的靶基因和证实TNFa–NF-kB的活性联合亲致瘤作用，通过RT–PCR（RT - PCR法）和Western blot分析后选基因的表达。

然而，一些已验证的靶基因(for
example, XIAP)，在NF – kB存在和缺乏的肝脏中表达很相似，A1/Bfl1, c-IAP1 和GADD45b在基因敲除的肝脏中明显增加(Supplementary Fig.3a, b)。

一致的是，在基因敲除小鼠中，抗-TNFa处理能阻止GADD45b和A1/Bfl1的诱导(Fig. 5b)。

可以想象，在肝脏，炎症过程能通过两个互相补充的臂促成肿瘤的发生(Fig. 5d)。

在基因敲除的肝脏中，一只臂负责诱导肝细胞增殖。

自身高速的DNA复制容易出错，而且能通过遗传毒性因子进一步改变肿瘤的形成18，其中有许多毒性因子在肝脏中有明确的活性（例如，黄曲霉素）19。

此外，肿瘤的促成需要第二个臂，能通过NF-kB的活性为细胞凋亡提供保护作用。

我们的数据表明，肿瘤坏死因子是抗细胞凋亡臂的主要推动力，这对依赖性抗凋亡基因才能激活的NF – kB来说是必要的，如A1/Bfl1和c - IAP1和GADD45b。

尽管在疾病发生的早期阶段，NF – kB是有活性的，但在长期的过程中，它是不必要的。

在此期间，癌前病灶积聚在发炎的肝脏，但在这些病灶转向恶性的阶段中至关重要。

可能在肿瘤发展阶段获得的致癌突变体致使癌变前的肝细胞对能够消除NF-kB活性的
细胞凋亡因子十分敏感。

假定在脆弱肿瘤的发展阶段的凋亡调控因子是p53和cJun(ref. 20)，TNF受体家族成员21和cJun氨基末端激酶（激酶）22。

在7个月的基因敲除的肝细胞中，能检测到JNK的活性和cJun的表达增加(Fig. 5c and Supplementary Fig. 3a)，围绕癌前高峰期变化（图3）。

和NF – kB相似，这些都是依赖于连续肿瘤坏死因子的信号，像基因敲除的小鼠的抗肿瘤坏死因子治疗，抑制肝脏JNK的活性和肝细胞cJun基因的表达（图5b中的C）。

通过NF - kB的靶点GADD45b ，JNK的活性易受NF - kB的抑制物的影响（参23，24）。

因此，通过GADD45b的抑制物，在基因敲除肝细胞中的NF - kB抑制物可提高JNK介导的细胞凋亡(Fig. 5b)，并能通过多倍NF-kB介导的抗细胞凋亡基因的抑制来促进半胱天冬酶介导的肝细胞凋亡(Supplementary Fig. 3)。

同时，由抗肿瘤坏死因子治疗（图5c）的cJun抑制物能够促进p53介导的细胞凋亡20。

因此，在慢性肝炎患者中，通过抑制多抗凋亡途径（Fig. 5d），抗肿瘤坏死因子治疗可作为预防人类肝癌的潜在模式。

最近，有关结肠炎症模型的研究支持了我们的结论，其中在肿瘤发生阶段，结肠IkB的激酶B（IKKb）的失活能导致上皮细胞凋亡25。

而炎症释放多种生长因子和细胞因子类1，26，我们的数据表明，肿瘤坏死因子具有激活NF – kB 的核心作用，并能保护已转化的肝细胞对抗细胞凋亡。

有人提出，如果旨在消除引起信号异常的原因，而不是仅仅处理最后的结果，或许抗癌研究会更有效27。

鉴于根除的首要原因，例如慢性肝炎，目前很难达到，破坏肿瘤发展不断产生的信号，可能是一个更现实的目标。

我们发现，短期消除上皮NF - kB的活性能诱导癌变前的细胞凋亡和制止肿瘤发展，足够支持这个猜想。

一大信号因子的间歇性抑制，如NF - KB或肿瘤坏死因子，因此可以成为一个延长癌前阶段的工具，并能在具有高风险癌症发生的慢性炎症性疾病中，抑制肿瘤发展。

Methods
以下内容能在参考文献中找到：
试剂，转基因小鼠的构建和基因型分析，RT–PCR，real-time PCR ，原位mRNA杂交, 肝细胞分离，western blot和肝细胞高倍染色体分析。

Animal studies and tissue preparation
所有的动物实验是在按照委员会制定的政策下执行，研究用的动物小鼠用致命麻醉剂量处死。

在体内荧光素酶成像和多西环素治疗按照参考文献11所描述的那样执行。

用20 ng人类TNFa重组体(Roche)进行动物腹腔注射，1h后，处死小鼠，
取出肝脏，进行p65免疫染色和RNA和蛋白提取。

对于抗肿瘤坏死因子的治疗，小鼠腹腔注射22 mg山羊抗小鼠肿瘤坏死因子的中和抗
(R&DSystems;AF-410-NA)，连续3天，或用山羊IgG作为对照。

所有的小鼠进行腹腔注射BrdU(Amersham; 100 ml per 10 g body weight) 3和24小时后，处死小鼠。

对于一些动物，取出肝脏样品，速冻，进行蛋白质和RNA分析。

用10毫升的冷肝素PBS通过左心室灌注该动物，其次再用4％的福尔马林缓冲液灌注25毫升。

取出肝脏，称重，拍摄，在夜间用福尔马林固定。

第二天，将整个肝脏用石蜡包埋在三到五个包埋盒里。

制成5毫米切片并用H＆E染色，然后让不知道它的遗传组成和处理组的病理学专家分析切片。

MRI analysis
用一个水平4.7T Biospec谱仪（BrukerMedical）做MRI，使用鸟笼线圈。

小麻醉鼠（30毫克/kg21巴比妥，i.p.）和使小鼠仰卧并使肝脏位于线圈的中心。

通过多层日冕和轴向T1，加权快速自旋，覆盖整个肝脏冠向和轴向的回波图像，来测定肝脏和肿瘤体积（重复时间，400毫秒;回波时间，17毫秒;切片厚度，1
毫米;视野，5厘米（冠状）和3.4厘米（轴向）使用256 ×256矩阵）。

由一个不知道其基因组成的观察员通过图像处理软件（NIH图像）来概述每个切片可看见的肝脏和肿瘤的边界，从而估计肿瘤和肝脏的体积，改变像素数（适用于肝脏和肿瘤）调到一个面积乘以系数（（视野）2×（矩阵）2）。

Immunohistochemistry
p65染色，在同一天制备5毫米切片，用不同浓度的酒精打蜡和水化，在高压锅里用pH6.0的25mM柠檬酸盐缓冲液煮沸，115℃，3分钟(decloaking chamber, Biocare Medical)，转移到沸腾上午
去离子水，降温20分钟。

5分钟后，在3％过氧化氢处理，在CAS-Block (Zymed)，用兔多克隆p65抗体（稀释1:100）孵育，室温下3小时，用Optimax (Biogenex)
洗三次，用抗兔Envisiont（DAKO）孵育30min，用DAB培养15min。

取回TNFa 抗原，在pH 9.0100 mM的甘氨酸缓冲液里进行p65双免疫染色。

5分钟后，3％H2O2处理，在CAS-Block，用山羊多克隆抗肿瘤坏死因子的抗体（稀释1:50）孵育1ħ，室温。

Optimax洗涤，用兔抗山羊抗体(1:100)孵育30min (Jackson Laboratories)，再用Optimax洗涤，用抗兔Envisiont（DAKO）孵育和AEC 培养，37℃，15分钟。

在此之后，在微波炉里，用100mM的甘氨酸缓冲液煮沸7min，再降至室温。

在CAS-Block (Zymed)，用兔多克隆p65抗体（稀释1:100）孵育，室温下3小时，用Optimax (Biogenex)洗三次，之后，在Tris缓冲液里，用4％的甲醛固定5分钟，Optimax洗涤，再用碱性磷酸酶共轭聚合物的抗兔IgG （Zymed）孵育30分钟，并用BCIP / NBT培养。

对核复染色，显示红色。

在pH 6.0的25mM柠檬酸盐的缓冲液里，进行CD3, cJun, BrdU, activated caspase-3, luciferase, MPO and Ki-67抗原。

抗原进行检索，TNFawas
在pH 9.0的100mM的甘氨酸缓冲液里。

每个抗体的免疫染色过程可应要求提供。

Nature AOP, published online 25 August 2004; doi:10.1038/nature02924。