NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子

NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子

NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子，目前关于致癌物质的研究比较多，但关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。PIKARSKY应用the Mdr2-knockout mouse（自发性胆汁郁积致肝癌模型），发现肝内皮细胞和炎细胞通过上调肿瘤坏死因子引发NF-kB，NF-kB与肿瘤形成密切相关，提示NF-kB 是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子，可能为慢性炎症所致肿瘤的预防提供可能的靶点。

我们还不清楚人类癌症的起因，但是，可以估计到，致癌物质的检测和慢性炎症是肿瘤发展的两个潜在条件，慢性炎症能够解释约20%的人类癌症1。因此，致癌物质的检测和癌症之间的因果关系已被广泛研究2。关于慢性炎症所致肿瘤发生的分子细胞机理仍不十分清楚。我们知道，在肿瘤中检常能测到核因子kB (NF-kB)（一种炎症反应的标志因子）的活性4,5，它可能是一种炎症和肿瘤的过度环节。为了验证这一假设，我们研究了敲除Mdr2基因的小鼠品系，能够通过肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎6，它是一种炎症与癌症相关的典型例子7。我们观察了敲除Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进，结果显示，在邻近的内皮和炎症细胞中，随着肿瘤坏死因子的上升，炎症过程能够触发肝细胞中的NF-kB因子。在七个月鼠龄的小鼠中，通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物IkB，来阻断NF-kB，这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。作为对照，通过抗肿瘤坏死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段，使用具有IkB的超级抑制物进行诱导，来抑制NF - kB的作用，导致转化的肝细胞发生细胞凋亡，破坏肝细胞癌的进展。因此，我们的研究表明，NF –kB能促进炎症相关的癌症，因此，是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。

肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因，通常是在慢性炎症的基础上发生8。根据在敲除Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展，我们已经证实了前期已开展实验的结果6，9，这和人类的肝癌非常相似，包括以下几个不同时期：炎症，异型增生，不典型增生结节（腺瘤样），癌转移（附图1a，b）。在敲除Mdr2基因小鼠中，肝炎是疾病的最早迹象，其特点是广泛的导管和汇管混合炎性浸润，在CD3阳性细胞中最丰富（附图1C）。

NF-kB 的活性常在人类肝癌中被检测到，尤其是在肝炎中8。根据RelA (p65)免疫染色，NF-kB 的活性可能与敲除了Mdr2的肝癌形成有关(Fig. 1a)。细胞核染色表明，NF-kB 的活性在基因敲除小鼠的所有年龄中都很明显。但在正常、年龄匹配的小鼠，这促使研究NF- kB活性在基因敲除小鼠的来源。在一些肿瘤，如霍奇金病和某些淋巴瘤，NF - kB的活化具有一种内在的，肿瘤自发的特点，可能与它的信号通路中的突变有关10。如果类似机制发生在Mdr2敲除的肝癌，在所有肿瘤的肝细胞中，人们会观察核NF- kB发生活化。然而，这并非如此; NF - kB的活化在实质中是分散的，主要是靠近有炎症的肝门（图1e中，左图），这意味着一个炎症引起的现象。为了评估这种可能性，我们给基因敲除和野生型小鼠饲喂非甾体抗炎药（NSAID）布洛芬10天。通过组织学分析（图1b），这种治疗方法能明显导致炎症减少，显着降低血清谷丙转氨酶（ALT），一种肝细胞损伤标志物（图1C）及中性粒细胞减少（图1C，D）。p65的免疫染色结果表明，在类固醇消炎药治疗组的肝细胞NF - kB的活化程度明显低于对照组。与此相反，在腹腔内的肿瘤坏死因子作用下，布洛芬并没有对肝细胞NF – kB活性产生影响（数据未显示）。因此，在基因敲除肝细胞中，似乎由炎症细胞引起的NF – kB活性对实质浸润是次要的。

在肝炎中，TNFa是一种类似NF-kB活性的介质，特别是它对细胞膜形成的作用，在基因敲除的肝脏中，属于正调节(Fig. 2a)。为了研究这一可能性，我们用具有中和作用的抗-TNFa抗体处理基因敲除的小鼠三天，然后进行分析肝细胞中NF-kB的活性。抗肿瘤坏死因子的治疗能消除肝细胞p65的核染色（图2b），进一步确定了NF - kB的活化主要由TNFa诱导的预测。要确定肝炎中肿瘤坏死因子的来源，我们把肝细胞分为野生型和基因敲除型（80％苏木纯度和-曙红（H＆E 染色））及其他细胞（2％肝细胞）。通过实时定量PCR分析TNFa表达的两种成分，已经确定TNFa的主要来源于无肝细胞部分，基因敲除型小鼠比野生型小鼠

的细胞和NF-kB活性间的关系，肝切片分别

。TNFa表达主要在肝门静脉处被检测到，包括内皮和炎症细胞(Fig. 2d)。由p65 染色的肝细胞核主要位于TNFa阳性的肝门静脉处(Fig. 2f),这表明肝细胞NF-kB主要经TNFa旁分泌的刺激引起活化。为了验证TNFa的产生者并能区分他们哪些是来自结合TNFa的细胞，野生型的肝切片和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠肝切片分别通过mRNA的原位杂交进行分析。和免疫染色的数据非常相似，在基因敲除小鼠的内皮和炎症细胞中，我们发现TNFa mRNA呈过高表达状态，野生型和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠则很少表达。在基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝细胞中，几乎检测不到TNFa的表达(Fig. 2e).

在基因敲除的肝细胞中，我们经常能检测到NF-kB的活性，这表明炎症相关的NF-kB活性能够促进肿瘤的生长4,5。为了能直接评估NF-kB在肝癌形成中的作用，我们用携带了两个转录基因的D N-I k Bhep小鼠繁殖了Mdr2基因敲除的小鼠：一个是由调节四环素的启动子控制的非降解D N-I k B，另一个是由特异性肝细胞C/EBPb启动子(TALAP1)11控制的四环素反转录因子。调节四环素的启动子也指导荧光素酶的表达，所以，可以用具有活性的小鼠荧光素酶11来检测转基因表达水平和组织特异性。根据具有Mdr2基因敲除的双转基因的DN - IkBhep小鼠与Mdr2敲除小鼠产生Mdr22 / 2的DN - IkBhep（双突变）小鼠服从NF - kB的调节。将来自具有抗荧光素酶抗体的相同的动物的肝脏进行免疫组织化学染色，结果表明，只有肝细胞表达转基因，而不是胆管上皮细胞，(Supplementary Fig. 2a)。和预测的一样，在基因敲除小鼠和用多西环素(抑制转基因)处理的小鼠中，p65 免疫染色检测到许多阳性的肝细胞核, 但在未经处理的双突变小鼠中则没有检测到(Supplementary Fig. 2b, c)。在基因敲除小鼠和双突变小鼠（不分多Dox（多西环素））(结果未显示)染色呈阳性的胆道细胞和Kupffer cells 都能被检测到，证明转基因在抑制NF-kB活性方面具有特异性和有效性。

因为，在敲除Mdr2小鼠中，肝炎起始于胆道系统6，它不应该受到特异性肝细胞D N-I k Bhep的影响。然而，在评估NF-kB在肿瘤形成中的作用之前, 我们想要排除在炎症形成过程中任何可能抑制NF-kB 的可能性因素。与那些年龄匹配的野生型小鼠相比，基因敲除小鼠和双突变小鼠都有较高的ALT水平(Fig. 3b)。将各组所有年龄的小鼠肝脏进行组织学分析，结果显示，和非化脓性胆管炎类似，肝门静脉扩张是由于胆管增生，一种混合性的肝门静脉炎性浸润和轻度至中度纤维化(Fig. 3a)。在肝门束和肝实质。这两个品系具有大量的阳性CD3和阳性髓过氧化物酶（MPO）细胞。因此，好像Mdr2敲除小鼠的基本炎症过程主要维持在双突变小鼠，与肝细胞的NF - kB活性无关。

Mdr2敲除肝细胞和野生型的区分主要依据几个异常功能：高增殖率，高染色体倍数和异常增生。而第一点也是肝损伤和部分肝切除的特点12，异型增生