细胞检测方法

丙二醛（MDA）分子式OHC-CH2-CHO ，分子量72.0634
测定原理
测定方法是丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5´-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收。

根据其532nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量。

实验原理示意图
实验方法
1.实验试剂
MDA试剂盒(50T)（南京建成生物工程研究所）；无水乙醇（北京北化精细化学品有限责任公司，分析纯）；冰醋酸（北京北化精细化学品有限责任公司，分析纯）；EDTA（北京拜尔迪生物公司）；Na2S2O5（北京拜尔迪生物公司）；PCA（北京北化精细化学品有限责任公司，分析纯）；实验用水为18.2MΩ三蒸水。

2.试剂盒组成
试剂一：液体10mL，室温保存，直接适用；
试剂二：液体6mL，加入170mL三蒸水混匀使用；
试剂三：粉剂，将1支50T的MDA3号粉剂倒入烧杯内加入90~100℃热蒸馏水32mL，充分溶解（溶解过程中可适当加热），冷却后加冰醋酸30mL混匀，配成母液可于－4℃保存。

用时将上述配好的试剂用50%的冰醋酸按2:1进行稀释，现用现配；
标准品：10nmol/mL四乙氧基丙烷5mL。

3.实验仪器
分光光度计；精密电子天平；台式冷冻高速离心；超声细胞破碎仪；恒温水浴锅或电磁炉。

4.实验方法
（1）取待测组织样品；
（3）称量待测组织样品的重量，按1mg:5µL的比例加入0.4mol/L的PC A溶液；
（4）再按组织重量1mg:14µL的比例加入0.86%的NaCl溶液；
（5）将组织剪碎后超声匀浆，并用旋涡混匀器混匀；
（6）按照表[1]加入试剂盒各反应试剂；
（7）用涡漩混匀器混匀样品，并在离心管管盖上刺一个小孔，于沸水浴中煮沸1h；
（8）反应过后，室温下放置冷却，在15,000g下离心10min，取上清液进行吸光度测定；
（9）以蒸馏水为空白对照，在532nm下，光径1cm，测定各个样品的吸光度值，带入MDA含量计算公式中，算出各样品中的MDA的含量，从而间接反映出各样品
氧化应激的程度（若测定管中蛋白含量不高，则可以使用标准空白管来代替测定空白管的吸光度值）。

实验图表
结果分析
根据组织中MDA含量的计算公式：
MDA实验
计算得到待测组织样品中的MDA的含量。

SOD的检测方法:
1.分光光度法
分光光度法是最为典型的检测SOD的方法，这种方法使用了细胞色素C(cytochrome C)或者氮蓝四唑（NBT）（图1）。

用cytochrome C的还原法来检测O2-是因为还原后的cytochrome C会生成紫色的染料（图解2）。

这是自SOD被发现以来最常用的方法
Cyt(FeⅢ) + O2- —> Cyt(FeⅡ) + O2
因为cytochrome C很容易被NADPH还原酶或者其他的还原剂所还原，因此必须要考虑样品的污染因素。

而且，这种方法需要每隔1.5分钟就要察看一下，因此不适合做大批量的实验。

NBT法的原理是生成不溶于水的蓝色甲臢染料(max: 560 nm)去和O2-反应。

这种染料不溶于水，在做长时程分析时会生成不均一的沉淀物，从而影响实验数据的重现性。

为了得到水溶性的甲臢染料，许多改良后的方法如添加BSA被人们所采用。

但是，添加了不必要的蛋白质会使数据分析变得十分复杂，而且NBT会被多种还原剂所还原。

NBT的这种特性被用于酮胺的检测，酮胺可以作为糖尿病的标记物并且是Maillard反应的中间体。

NBT法的最大缺点是即使加入过量的SOD也不能获得100%的抑制率，原因是NBT会与黄嘌呤氧化酶直接反应。

2.化学发光法
用于O2-检测的化学发光探针同样也能用于SOD的检测，这种探针分为2种，一种是光泽精，另一种是荧光素衍生物（MCLA）。

这种化学发光反应对pH有高度的依赖性。

例如，光泽精只有在pH 9.0或者更高处会发出强烈的化学光。

因此，在生理的pH条件下用这种方法检测SOD是不可行的。

另一方面，MCLA在生理条件下能够发出较强的化学荧光，因此可以用于人脑的Cu,Zn-SOD活性的检测。

但是，MCLA不适合用作SOD检测的探针，因为它不单单和O2-反应，还会和单质氧反应。

而且MCLA与溶解氧反应后会发出化学光，转移的金属离子还会加速氧化反应。

3.电子自旋共振（ESR）光谱法
在室温下，溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出，但能够通过自旋捕捉法间接获得。

最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。

由于O2- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图，因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种。

然而，DMPO 与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：终浓度为0.45M）。

这样，每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。

这种方法的另一个问题是在实验中需要一套较为昂贵的ESR设备。

4．利用水溶性四唑盐检测SOD的新方法
为了克服上述的诸多问题，我们在做SOD检测时需要考虑如下几个方面：实验设备要简单、经济，pH灵敏度要低，对O2-有高度的特异性。

如果用分光光度计作为一种简单的实验设备的话，就需要一种与cytochrome C和NBT相似的比色探针。

检测中最重要的一点是在没有其他物质干扰的情况下，测定出SOD100%的抑制率。

为了得到一种新的检测SOD的方法，我们对还原后能生成水溶性甲臢的四唑盐作了一系列的实验。