血管周围脂肪组织在肾性高血压血管重构中的作用

摘要 目的：探讨血管周围脂肪组织（ＰＶＡＴ）与肾性高血压血管重构的相关 性 及 其 可 能 的 机 制 。 方 法：用 两 肾 一 夹 型 （左 侧 肾 动脉狭窄，右侧肾保留，２ｋ１ｃ）建立肾性高血压大鼠模型，将３０只 ＳＤ 大鼠随机分为假手术组（ＳＨ）和肾 性 高 血 压 组（ＲＨ），术 前 及术后１２周末检测大鼠尾动脉血压、心率。放射免疫法 检 测 脂 肪 组 织 血 管 紧 张 素 Ⅱ （ＡｎｇⅡ）水 平。 采 用 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检测血管紧张素原（ＡＧＴ）和 血 管 紧 张 素 酶 （ＡＣＥ）ｍＲＮＡ 表 达。 采 用 ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检 测 血 管 紧 张 素 受 体 １（ＡＴ１）和 受 体 ２ （ＡＴ２）蛋白表达。并检测 ＰＶＡＴ 过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）含量。结果：２ｋ１ｃ术后１２周 ＲＨ 组大 鼠 胸 主 动 脉 发 生 血 管 重 构 ，ＡｎｇⅡ 水 平、ＡＧＴ、ＡＣＥ ｍＲＮＡ 表达均高于 ＳＨ 组，ＡＴ１蛋白表达量和 Ｈ２Ｏ２含量也高于 ＳＨ 组，而 ＡＴ２蛋白量表达两组差异无统计学 意义（Ｐ ＞０．０５）。结论：ＰＶＡＴ 与肾性高血压血管重构相关，活性氧（ＲＯＳ）可能参与其发生机制。 关 键 词 血 管 周 围 脂 肪 组 织 ；血 管 紧 张 素 Ⅱ ；过 氧 化 氢 中 图 分 类 号 ：Ｒ５４４．１＋４ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－９３０Ｘ（２０１２）０２－０１８９－０４
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广 西 医 科 大 学 学 报 ２０１２ Ａｐｒ；２９（２）
（０．３ｍＬ／１００ｇ）腹腹腔 注 射，将 ＳＤ 大 鼠 仰 卧 固 定 在 手 术 台 上，腹部脱毛后，５％碘 伏 消 毒 和 ７５％ 酒 精 脱 碘 后，按 无 菌 操 作，于腹中线中部 偏 左 １ｃｍ 处 做 手 术 切 口，打 开 腹 腔，钝 性 分离出左肾动脉后穿入无菌丝线，将直径０．２５ｍｍ 的针灸针 放置在与肾动脉血管长轴平行 处，无 菌 丝 线 扎 紧 肾 动 脉 和 针 灸针后抽出针灸针，造成单 侧 肾 动 脉 狭 窄［４］。 假 手 术 组 手 术 方式同２ｋ１ｃ组，只 是 不 予 结 扎 左 肾 动 脉 。 所 有 实 验 大 鼠 均 喂以常规固体 饲 料，自 由 饮 水，室 温 控 制 在 ２０ ℃ 左 右，遵 循 １２ｈ 昼 夜 规 律 。 １．２ 血管 组 织 标 本 的 处 理：术 后 １２ 周 ＲＨ 组 与 ＳＨ 组 大 鼠 处 死 后 ，开 胸 迅 速 在 各 组 大 鼠 取 出 一 小 段 胸 主 动 脉 （３～４ ｍｍ 长主动 脉 环 ）置 于 冰 浴 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ＰＢＳ）中 洗 涤。 预 冷 ＰＢＳ（０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ ，ｐＨ＝７．４）灌 洗，滤 纸 吸 干，并 在 ４ ℃ 下 分离 ＰＶＡＴ，血管沿 横 轴 切 取 ０．４ｃｍ 厚 的 血 管 环 组 织 置 于 １０％甲醛中固定，石蜡切片，用 作 ＨＥ 染 色，图 像 分 析 仪 测 定 主 动 脉 重 构 的 指 标 ：中 层 壁 厚 （ｉｎｔｉｍａ－ｍｅｄｉａ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ，ＭＴ）、 管腔内径（ｌｕｍｅｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＤ）、中膜壁厚／管腔内径 比（ＭＴ／ ＬＤ），测量时统一采用显微镜 ×４００ 倍 放 大，随 机 选 取 ３ 个 视 野取其均值。 １．３ 脂肪组 织 匀 浆 中 血 管 紧 张 素 Ⅱ （ＡｎｇⅡ ）测 定：分 别 取 ＲＨ 大鼠和 ＳＨ 大鼠血 管 周 围 脂 肪 组 织 约 ５０ ｍｇ 左 右，加 冰 冷的含１０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４、１％ ＢＳＡ 的 试 管 中，内 切式电动匀浆器高速 匀 浆 后，４ ℃、３ ５００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ， 取上清置于含０．３４ｍｏｌ／Ｌ ８－羟 基 喹 啉 ５０μＬ 及 ０．３２ ｍｏｌ／Ｌ ２－巯基乙醇２５μＬ 的试管中，混匀后，４ ℃、１５ ０００ｒ／ｍｉｎ离心 １５ｍｉｎ，取上清－７０ ℃保存。按北京北方 生 物 技 术 研 究 所 提 供的试剂盒说明，用放射免疫法测定 ＡｎｇⅡ。 １．４ ＰＶＡＴ 中 ＡＧＴ 和 ＡＣＥ 的 ｍＲＮＡ 表达 １．４．１ 分 别 取 ＲＨ 大 鼠 和 ＳＨ 大 鼠 血 管 周 围 脂 肪 组 织 。 ＰＣＲ 引物由上 海 生 物 生 工 工 程 有 限 公 司 设 计 合 成 ：①ＡＧＴ （扩增 片 段 长 度 １５９ｂｐ）：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ 为 ５′－ＡＴＡ ＣＡＴ ＣＣＡ ＣＣＣ ＣＴＴ ＴＣＡ ＴＣＴ Ｃ－３′，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ为 ５′－ＴＴＡ ＴＣＴ ＣＧＣ ＡＧＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＣＡ Ｔ－３′。②ＡＣＥ（扩 增 片 段 长 度 １０４ ｂｐ）：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ 为 ５′－ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＴＡ ＴＧＡ Ｃ－３′，Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ 为 ５′－ＴＣＴ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＣＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＧＴＡ ＡＴ－３′。 １．４．２ 采用 Ｔｒｉｚｏｌ提取组织总 ＲＮＡ，构建２０μＬ 总 体 积 的 ＰＣＲ 逆 转 录 反 应 体 系，７０ ℃ ５ ｍｉｎ，４２ ℃ ５０ ｍｉｎ，９５ ℃ ５ｍｉｎ 条件下制备ｃＤＮＡ。 １．４．３ 以预实验中 ＰＣＲ 阳性产物回收，经鉴定、测定浓度后
ＪＯＵ广ＲＮＡＬ西 ＯＦ Ｇ医ＵＡＮ科ＧＸＩ Ｍ大ＥＤＩＣＡ学Ｌ ＵＮ学ＩＶＥＲ报ＳＩＴＹ ２０１２ Ａｐｒ；２９（２）
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血管周围脂肪组织在肾性高血压血管重构中的作用
史吉莹 刘唐威△ 黄荣杰 林葆菁 莫剑梅 蒋智渊
（广 西 医 科 大 学 第 一 附 属 医 院 高 血 压 病 区 南 宁 ５３００２１）
ＥＦＦＥＣＴＳ ＯＦ ＰＥＲＩＶＡＳＣＵＬＡＲ ＡＤＩＰＯＳＥ ＴＩＳＳＵＥ ＯＮ ＶＡＳＣＵＬＡＲ ＲＥＭＯＬＤＩＮＧ ＩＮ ＲＥＮＡＬ
ＨＹＰＥＲＴＥＮＳＩＯＮ
Ｓｈｉ Ｊｉｙｉｎｇ，Ｌｉｕ Ｔａｎｇｗｅｉ，Ｈｕａｎｇ Ｒｏｎｇｊｉｅ，Ｌｉｎ Ｂａｏｊｉｎｇ，Ｍｏ Ｊｉａｎｍｅｉ，Ｊｉａｎｇ Ｚｈｉｙｕａｎ．（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｙ－ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ （ＰＶＡＴ）ｏｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｅｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｗｏ ｋｉｄｎｅｙ ｏｎｅ ｃｌｉｐ （２ｋ１ｃ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｉｒｔｙ ＳＤ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｓｈａｍ （ＳＨ）ａｎｄ ｒｅｎａｌ ｈｙ－ ｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ（ＲＨ，ｎ ＝１５ｆｏｒ ｅａｃｈ）．Ａｌｌ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｃａｕｄａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ（ＨＲ） ａｆｔｅｒ １２ｗｅｅｋｓ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ （Ａｎｇ）Ⅱ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＧＴ ａｎｄ ＡＣＥ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴ１ａｎｄ ＡＴ２ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ．Ｈ２Ｏ２ ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ＰＶＡＴ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｗｅｌｖｅ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ａｏｒｔｉｃ ｒｅｍｏｌｄｉｎｇ ｗａｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｉｎ ＲＨ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ａｎｇ Ⅱ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＧＴ，ＡＣＥ，ＡＴ１ａｎｄ Ｈ２Ｏ２ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ＲＨ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｉｎ ＳＨ ｇｒｏｕｐ．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＡＴ２ ｗａｓ ｅｑｕａｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰＶＡＴ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｌｄｉｎｇ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．ＲＯＳ ｍａｙ ｂｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｍｏｌｄｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＰＶＡＴ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ；ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ⅱ；Ｈ２Ｏ２
近年随着对高血压的深入 研 究，已 证 实 高 血 压 及 其 并 发 症 的 发 生 发 展 与 血 管 重 构 密 切 相 关 。 ［１，２］ 因 此 ，高 血 压 发 展 过程中血管重构的类型、特点及 发 生 机 制 成 为 高 血 压 研 究 的 热点之一。 血 管 周 围 脂 肪 组 织 （ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ， ＰＶＡＴ）可能对于血管结构的维持起到一定作用，因为 ＰＶＡＴ 产生的许多分子影响了平滑肌细胞的增殖 、游走［３］。
虽然目前还没有直 接 的 证 据 证 实 ＰＶＡＴ 对 平 滑 肌 细 胞 的增殖和迁移产生效应，但是作 为 局 部 的 肾 素 血 管 紧 张 素 系
△ 通 信 作 者 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕ＿ｔａｎｇ＿ｗｅｉ＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ 收 稿 日 期 ：２０１１－１２－０７
统（ＲＡＳ），ＰＶＡＴ 有可能在生理 和（或）病 理 状 态 下 对 平 滑 肌 细胞增殖和迁移产生作用。因 此，本 实 验 旨 在 通 过 肾 性 高 血 压模型，观察 ＰＶＡＴ 中 ＲＡＳ 各 相 关 成 分 的 表 达 与 动 脉 重 构 的相关性。
作为阳性标准品，并取阳性标准品５μＬ 按１０倍稀释，依次稀 释，制备成阳性定量标准品梯 度。 以 灭 菌 蒸 馏 水 作 为 阴 性 质 控标准品。构建２０μＬ 总 体 积 的 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 反 应 体 系，反应条件为９３ ℃ ３ ｍｉｎ，然 后 ９３ ℃ ３１ｓ，６０ ℃ ５０ｓ，共 ４０个循环。绘制 ＡＧＴ、ＡＣＥ 和 内 参 的 扩 增 曲 线、熔 解 曲 线， 测定 Ｃｔ值 和 ＲＮＡ 相 对 拷 贝 数 （每 个 标 本 测 ３ 次 Ｃｔ后 取 平 均数作为平均 Ｃｔ值），计算相对比值（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ，ＲＲ ）（目 的 基 因 相 对 拷 贝 数／内 参 相 对 拷 贝 数 ）用 作 目 的 基 因 定 量 。 １．５ ＰＶＡＴ 中 ＡＴ１和 ＡＴ２的蛋白表达：分别取各组大鼠血 管 周 围 脂 肪 ，使 用 凯 基 全 蛋 白 提 取 试 剂 盒 提 取 总 蛋 白 。取５０μＬ 稀释适当倍数后的组织总蛋白待测样品，存于－８０ ℃。 将 存 于－８０ ℃冰箱中标本解冻后加入组织裂解液制成匀浆 液，高 速离心后取上清液与 上 样 缓 冲 液 混 匀 加 热 后 置 入 －２０ ℃ 冰 箱中保存。先 后 灌 制 分 离 胶 和 积 层 胶，加 电 泳 缓 冲 液 后 上 样，电泳完毕后将蛋白转印于硝酸纤维素膜上。脱脂奶 粉 封 闭膜后加入兔抗鼠 ＡＴ１多克隆抗体和兔抗鼠 ＡＴ２单克隆抗 体，４ ℃过夜，洗膜，加辣根过 氧 化 物 酶 （ＨＲＰ）标 记 的 羊 抗 兔 ＩｇＧ。洗膜 后 加 入 免 疫 印 迹 化 学 发 光 试 剂 （ＥＣＬ），显 影、洗 片、晾干。蛋白质 印 迹 结 果 均 经 过 多 次 重 复 ，用 凝 胶 图 像 分 析仪扫描照片。然后再用四星图像处理系统测定各组特异 性蛋白表达量（条 带 灰 度 值）与 内 参 （α－ａｃｔｉｎ）表 达 量 的 比 值， 以此比值作为各自表达水平的参数。 １．６ ＰＶＡＴ 过氧化 氢 检 测：将 ＰＶＡＴ 组 织 称 重，按 照 １∶９ 加入生理盐水，匀浆，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离 心 １０ ｍｉｎ，取 上 清 １０％ 匀 浆 待 测。 空 白 管、标 准 管、测 定 管 各 加 入 １ ｍＬ 试 剂 一 （３７ ℃预温），上述各 管 分 别 加 入 蒸 馏 水、１６３ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２Ｏ２ 标准 品 应 用 液、待 测 样 本 均 为 １００ μＬ，混 匀 后 ３７ ℃ 反 应 １ｍｉｎ，各 管 分 别 加 入 １ ｍＬ 试 剂 二，混 匀，于 ４０５ｎｍ 处 测 各 管吸光度值。 １．７ 统计学方法：采用 ＳＰＳＳ １３．０ 统 计 软 件，各 计 量 资 料 数 据 以均数±标准差（ｘ珚±ｓ）表示。两组比较采用ｔ检验，Ｐ ＜ ０．０５ 为 差 异 有 统 计 学 意 义 。
１ 材 料 和 方 法
１．１ 实验 动 物 模 型：雄 性 ＳＤ 大 鼠 ３０ 只，体 重 １８０～２００ｇ， 购自广 西 医 科 大 学 实 验 动 物 中 心 ，许 可 证 编 号：ＳＣＸＫ 桂 ２００９－０００２。随机分为两组：两肾一夹型（左侧肾 动 脉 狭 窄，右 侧肾保 留，２ｋ１ｃ）肾 性 高 血 压 组 （Ｒｅｎａｌ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，ＲＨ）和 假手术组（Ｓｈａｍ，ＳＨ）。２ｋ１ｃ手 术：麻 醉 用 １０％ 的 水 合 氯 醛