补肾健脾_养血通利中药对多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞自噬影响的实验研究
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
·文献综述·
数据挖掘在中医药防治疾病研究中的应用现状 *
王 玮 李 霞 郭秀花
【关键词】 中医药；数据挖掘；数学模型；文献综述
中医药是目前世界上保存最完整、最系统的传 统医学之一。数据挖掘是适应大量信息储存之后进 一步分析其内在规律的要求而发展起来的信息技 术，是从数据中发现有用模式的过程[1]。将中医文献 或临床诊疗过程数据化，选用合适的数学模型及恰 当的数据挖掘方法能够反映中医思想的科学性，协 助辨证过程，寻找用药规律，为中医理论的传承与发 展提供帮助。数据挖掘克服了传统多元统计方法假 设各变量间不存在相互作用的缺陷[2]，能够达到分 类、估值、预测、关联规则、聚集、描述和可视化等目
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
高于正常组；模型组卵巢组织学切片出现囊状卵泡 明显增多，黄体形成减少。说明多囊卵巢综合征大鼠 造模成功。
图 1 正常组大鼠卵巢形态（×20）
图 2 模型组大鼠卵巢形态（×20）
表 1 各组大鼠体重与血清激素水平比较（x±s）
项目 例数
体重
组别 （只）
（g）
T （ng·mL-1）
E2 （pg·mL-1）
FSH
LH
（mIU·mL-1） （mIU·mL-1）
正常组 8 260.00±10.49*△ 0.076±0.052* 92.955±21.588 1.509±0.414 1.320±0.478
模型组大鼠血清睾酮（T）的含量明显高于正常 组、中药组及阳性药组，模型组与正常组、中药组、阳 性药组之间均有显著差异（P <0.05），正常组、中药 组、阳性药组之间均无组间差异（P >0.05）。模型组的 促黄体生成素（LH）水平与阳性药组相比有显著差异 （P <0.05），其他各组间差异不明显。而各组间雌二醇 （E2）与促卵泡生成素（FSH）之间的差异不明显。见 表 1。
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
·235·
补肾健脾、养血通利中药对多囊卵巢综合征 大鼠颗粒细胞自噬影响的实验研究
佟 庆1 金 哲1 刘 欣2
大鼠腹腔注射 0.4 %戊巴比妥 1 mL·（100 g）-1 使大鼠昏迷后，75 %酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔， 腹主动脉取血 4 mL，1500 rpm 离心 5 min，取血清送 检。 2.3 组织学鉴定
大鼠腹腔注射 0.4 %戊巴比妥 1 mL·（100 g）-1
·236·
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
作者单位：1. 100078，北京中医药大学东方医院 2. 100010，北京市中医研究所
通信作者：金哲，Tel：（010）67689728，E- mail：jinzhe1954@sohu.com
B0803）等。 1.3 仪器
超净工作台（哈东联，中国），倒置显微镜（IMT Olympus，日本），离 心 机（2- 16k 型 ，Sigma 公 司 ，美 国），放免仪 （xh6080，西安核仪厂），流式细胞仪 （FACSCalibur，BD 公司，美国）等。 2 方法 2.1 模型的建立及动物分组 2.1.1 动物模型的建立[1]：实验组大鼠 40 只灌服来曲 唑 1mg·kg-1·d-1，溶于 1％羧甲基纤维素（CMC）中，连 续灌服 21 天；正常对照组大鼠 8 只同期灌服等容积 等浓度的基质 CMC。 2.1.2 动物分组及用药：将实验组 40 只大鼠分为模 型组 8 只、中百度文库组 16 只、阳性药组 16 只。中药组每 日灌服补肾健脾、养血通利法中药汤剂（中药组以中 药 3 mL 灌胃，将相当于成人常用量按体表面积折 算），连续用药 24 天。阳性药组于前 19 日灌服等剂 量蒸馏水，于最后 5 天灌服枸橼酸氯米芬溶液（相当 于成人 50 mg/ 日用量）。正常组与模型组则灌服等剂 量蒸馏水，连续灌服 24 天。 2.2 血清学鉴定
的，在中医药领域中可以较为准确地模拟症状与症 候之间的复杂关系。数据挖掘技术在医药研究领域 的应用中较早见于基因组及蛋白组分析[3]，在中医领 域主要用于证型归纳、治法和遣方用药规律的探索[4]。 本文拟对常用数据挖掘方法的特点及其在中医药临 床研究中的应用实例进行简要介绍。 1 关联规则
在数据挖掘中，关联模式就是描述特征之间或 者数据之间的相互依赖关系。通过关联规则挖掘算 法，可以得到同时出现的症状组合、药物配伍等信
图 7 中药组颗粒细胞自噬率
表 2 各组大鼠颗粒细胞自噬率的比较
组别 正常组 模型组 中药组 西药组
卵巢数（只） 8 8 16 16
自 噬 率 （% ） 7.40±0.40* 18.00±1.20#△ 8.25±1.24* 9.85±2.60*
与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.05；与西药组比
较，△P＜0.05
图 5 正常组颗粒细胞自噬率 图 6 模型组颗粒细胞自噬率
图 8 西药组颗粒细胞自噬率
4 讨论 我们经过多年临床观察，发现临床上相当一部
分 PCOS 患者中医辨证属脾肾不足、湿浊结聚证候， 多表现为月经稀发或闭经，经量稀少，或崩漏，食少 而形体偏胖，大便不爽或稀溏，腰膝酸软，带下量多， 舌体多胖大，舌质多淡或嫩暗，脉沉细或沉细滑。正 如《傅青主女科》“妇人有身体肥胖，痰涎甚多不能受 孕者，……而肥胖之湿实非外邪，乃脾土之内病也， ……不知湿盛者多肥胖，肥胖者多气虚，气虚者多痰 涎。外似健壮而内实虚损也……。且肥胖之妇内肉必 满，遮隔子宫不能受精，此必然之势也。”结合现代医 学研究中发现的卵巢增大、呈灰白色、白膜增厚等表 现，运用中医基础理论，从宏观和微观两层面辨证论 治，应用补肾健脾、养血通利法治疗脾肾不足、湿浊 结聚型 PCOS，从肺、脾、肾三脏论治，补肾健脾同时， 补肺利水，通调水道，取其“提壶揭盖”之意，上下通 达，攻补兼施，在临床已取得了显著的疗效。本课题 实验旨在发现其作用机制，以利于更好地总结完善。
与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.05；与阳性药组
比较，△P＜0.05
图 3 中药组大鼠卵巢形态（×20）
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
【摘要】 目的 观察补肾健脾、养血通利中药对于 PCOS 大鼠激素及卵巢形态及卵巢颗粒细胞自噬发生的影响，从而探索中 药治疗 PCOS 的相关作用机制。方法 建立来曲唑诱导 PCOS 大鼠动物模型，灌服中药治疗，并以氯米芬为阳性对照组，与正常 组、模型组进行对照，检测大鼠用药后激素水平、卵巢结构，并应用 MDC 荧光染色及流式细胞术测定大鼠颗粒细胞自噬率的差 别。结果 补肾健脾、养血通利中药能够有效改善大鼠内分泌，可恢复卵巢颗粒细胞数量，抑制颗粒细胞过度自噬。结论 补肾健 脾、养血通利中药可通过改善卵巢颗粒细胞自噬，从而改善卵巢 PCO 状态。
模型组 8 290.25±8.68# 0.537±0.309#△ 70.430±14.490 1.633±0.350 1.490±0.461△
中药组 16 271.69±11.35* 0.082±0.069* 76.533±17.323 1.805±0.454 1.075±0.799
阳性药组 16 282.19±18.98# 0.033±0.021* 91.876±18.274 1.751±0.401 1.109±0.629*
6 周龄雌性 SD 大鼠，体重（200±10）g，购自中 国医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK（京） 2006- 2009。 1.2 试剂
来曲唑 （购自首都医科大学附属北京中医医 院），单磺尸胺 MDC （购自美国 Sigma 公司，CAT.： 30432），羧甲基纤维素 CMC（购自国药集团化学试 剂有限公司，批号：F20070608），中药复方剂（由菟丝 子、杜仲、当归、南沙参、茜草、车前子等组成，生药由 北京中医药大学东方医院中药房提供，并由北京中 医研究所制剂室协助煎煮，过滤，浓缩每 1 mL 相当 于生药 1 g），枸橼酸氯米芬片（塞浦路斯生产，批号
·237·
图 4 阳性药组大鼠卵巢形态（×20）
3.4 各组大鼠颗粒细胞自噬率的比较 各组大鼠的卵巢颗粒细胞自噬率检测，荧光强
度模型组 > 西药组 > 中药组 > 正常组。组间两两比 较，模型组与正常组、中药组、西药组之间均存在显 著性差异（P <0.05），而正常组、中药组、西药组组间 比较，均无显著性差异（P >0.05）。见表 2，图 5～8。
采用 SPSS 19.0 软件包。计量资料以均数±标准 差（x±s）表示，多组间比较以单因素方差分析（OneWay ANOVA）。 3 结果 3.1 各组大鼠体重的比较
模型组大鼠体重明显增加，明显高于正常组，组 间有显著性差异（P <0.01）；阳性药组大鼠体重也有 增加，与模型组比较无显著性差异（P >0.05），与正常 组比较，有显著性差异（P <0.01）。中药组大鼠体重 明显小于模型组，组间比较有显著性差异（P <0.01）， 而与正常组、阳性药组比较均无显著性差异（P >0.05）。 见表 1。 3.2 各组大鼠血清激素水平的比较
通过模型组与正常组大鼠体重、血清激素水平、 卵巢形态学等多方面比较，观察到模型组大鼠比正 常组大鼠体重增加明显；模型组大鼠血清睾酮水平
·238·
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
3.3 各组大鼠卵巢形态的比较 倒置显微镜下放大 20 倍，观察各组间卵巢形态
学变化，可见模型组大鼠卵泡多数成囊性扩张，可见 囊性窦卵泡，颗粒细胞层数减少，仅有 1- 2 层，且排 列稀疏，黄体组织数量明显减少。正常组大鼠卵泡结 构清晰，颗粒细胞排列整齐均匀，可达到 8- 9 层，大 部分可见卵丘。中药组卵巢可见少许囊性窦卵泡的 出现，可见成熟卵泡，颗粒细胞数较模型组明显增 加，为多层，可见黄体。氯米芬西药组亦可见部分囊 性窦卵泡，颗粒细胞为多层，排列比较整齐，黄体组 织较少。见图 1～4。
使大鼠昏迷后，75 %酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔， 取大鼠卵巢。观察卵巢形态，卵巢体积增大，可见多 个小卵泡，福尔马林固定，制作石蜡切片，HE 染色。 2.4 卵巢颗粒细胞自噬率的测定[2]
无菌取出卵巢，放入生理盐水中清洗 3 遍，体镜 下小心剔除卵巢周围脂肪组织，体镜下用 1 mL 注射 器针头刺破卵泡，PBS 冲洗，用 200 目过滤，800 rpm 离心 5 min，弃上清，用 PBS 将收集的细胞调至浓度 为 1×106·mL-1。0.05 mmol/LMDC 染色，37℃温育 60 min，PBS 清洗后，采用流式细胞仪定量分析其着色 荧光强度（488 nm 激发波长，检测 10000 个细胞），从 而比较各组大鼠颗粒细胞的自噬发生率。 2.5 统计学方法
【关键词】 多囊卵巢综合征；自噬；颗粒细胞；大鼠；补肾健脾、养血通利法；实验研究
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种多发于育龄期 的内分泌失调疾病，是引起女子月经失调、不孕的常 见疾病之一。目前对于 PCOS 的病因仍不明确，中西 医治疗均疗效欠佳。研究表明，颗粒细胞与卵细胞成 熟和排卵密切相关。自噬作为一种新的程序性细胞 死亡方式，与凋亡有着密切的关系，近年来吸引了越 来越多科学家的注意。本课题旨在发现自噬在 PCOS 发生中的作用，了解 PCOS 卵巢颗粒细胞减少的内 在原因，探索补肾健脾、养血通利法治疗多囊卵巢综 合征的作用机制。 1 材料 1.1 动物
数据挖掘在中医药防治疾病研究中的应用现状 *
王 玮 李 霞 郭秀花
【关键词】 中医药；数据挖掘；数学模型；文献综述
中医药是目前世界上保存最完整、最系统的传 统医学之一。数据挖掘是适应大量信息储存之后进 一步分析其内在规律的要求而发展起来的信息技 术，是从数据中发现有用模式的过程[1]。将中医文献 或临床诊疗过程数据化，选用合适的数学模型及恰 当的数据挖掘方法能够反映中医思想的科学性，协 助辨证过程，寻找用药规律，为中医理论的传承与发 展提供帮助。数据挖掘克服了传统多元统计方法假 设各变量间不存在相互作用的缺陷[2]，能够达到分 类、估值、预测、关联规则、聚集、描述和可视化等目
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
高于正常组；模型组卵巢组织学切片出现囊状卵泡 明显增多，黄体形成减少。说明多囊卵巢综合征大鼠 造模成功。
图 1 正常组大鼠卵巢形态（×20）
图 2 模型组大鼠卵巢形态（×20）
表 1 各组大鼠体重与血清激素水平比较（x±s）
项目 例数
体重
组别 （只）
（g）
T （ng·mL-1）
E2 （pg·mL-1）
FSH
LH
（mIU·mL-1） （mIU·mL-1）
正常组 8 260.00±10.49*△ 0.076±0.052* 92.955±21.588 1.509±0.414 1.320±0.478
模型组大鼠血清睾酮（T）的含量明显高于正常 组、中药组及阳性药组，模型组与正常组、中药组、阳 性药组之间均有显著差异（P <0.05），正常组、中药 组、阳性药组之间均无组间差异（P >0.05）。模型组的 促黄体生成素（LH）水平与阳性药组相比有显著差异 （P <0.05），其他各组间差异不明显。而各组间雌二醇 （E2）与促卵泡生成素（FSH）之间的差异不明显。见 表 1。
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
·235·
补肾健脾、养血通利中药对多囊卵巢综合征 大鼠颗粒细胞自噬影响的实验研究
佟 庆1 金 哲1 刘 欣2
大鼠腹腔注射 0.4 %戊巴比妥 1 mL·（100 g）-1 使大鼠昏迷后，75 %酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔， 腹主动脉取血 4 mL，1500 rpm 离心 5 min，取血清送 检。 2.3 组织学鉴定
大鼠腹腔注射 0.4 %戊巴比妥 1 mL·（100 g）-1
·236·
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
作者单位：1. 100078，北京中医药大学东方医院 2. 100010，北京市中医研究所
通信作者：金哲，Tel：（010）67689728，E- mail：jinzhe1954@sohu.com
B0803）等。 1.3 仪器
超净工作台（哈东联，中国），倒置显微镜（IMT Olympus，日本），离 心 机（2- 16k 型 ，Sigma 公 司 ，美 国），放免仪 （xh6080，西安核仪厂），流式细胞仪 （FACSCalibur，BD 公司，美国）等。 2 方法 2.1 模型的建立及动物分组 2.1.1 动物模型的建立[1]：实验组大鼠 40 只灌服来曲 唑 1mg·kg-1·d-1，溶于 1％羧甲基纤维素（CMC）中，连 续灌服 21 天；正常对照组大鼠 8 只同期灌服等容积 等浓度的基质 CMC。 2.1.2 动物分组及用药：将实验组 40 只大鼠分为模 型组 8 只、中百度文库组 16 只、阳性药组 16 只。中药组每 日灌服补肾健脾、养血通利法中药汤剂（中药组以中 药 3 mL 灌胃，将相当于成人常用量按体表面积折 算），连续用药 24 天。阳性药组于前 19 日灌服等剂 量蒸馏水，于最后 5 天灌服枸橼酸氯米芬溶液（相当 于成人 50 mg/ 日用量）。正常组与模型组则灌服等剂 量蒸馏水，连续灌服 24 天。 2.2 血清学鉴定
的，在中医药领域中可以较为准确地模拟症状与症 候之间的复杂关系。数据挖掘技术在医药研究领域 的应用中较早见于基因组及蛋白组分析[3]，在中医领 域主要用于证型归纳、治法和遣方用药规律的探索[4]。 本文拟对常用数据挖掘方法的特点及其在中医药临 床研究中的应用实例进行简要介绍。 1 关联规则
在数据挖掘中，关联模式就是描述特征之间或 者数据之间的相互依赖关系。通过关联规则挖掘算 法，可以得到同时出现的症状组合、药物配伍等信
图 7 中药组颗粒细胞自噬率
表 2 各组大鼠颗粒细胞自噬率的比较
组别 正常组 模型组 中药组 西药组
卵巢数（只） 8 8 16 16
自 噬 率 （% ） 7.40±0.40* 18.00±1.20#△ 8.25±1.24* 9.85±2.60*
与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.05；与西药组比
较，△P＜0.05
图 5 正常组颗粒细胞自噬率 图 6 模型组颗粒细胞自噬率
图 8 西药组颗粒细胞自噬率
4 讨论 我们经过多年临床观察，发现临床上相当一部
分 PCOS 患者中医辨证属脾肾不足、湿浊结聚证候， 多表现为月经稀发或闭经，经量稀少，或崩漏，食少 而形体偏胖，大便不爽或稀溏，腰膝酸软，带下量多， 舌体多胖大，舌质多淡或嫩暗，脉沉细或沉细滑。正 如《傅青主女科》“妇人有身体肥胖，痰涎甚多不能受 孕者，……而肥胖之湿实非外邪，乃脾土之内病也， ……不知湿盛者多肥胖，肥胖者多气虚，气虚者多痰 涎。外似健壮而内实虚损也……。且肥胖之妇内肉必 满，遮隔子宫不能受精，此必然之势也。”结合现代医 学研究中发现的卵巢增大、呈灰白色、白膜增厚等表 现，运用中医基础理论，从宏观和微观两层面辨证论 治，应用补肾健脾、养血通利法治疗脾肾不足、湿浊 结聚型 PCOS，从肺、脾、肾三脏论治，补肾健脾同时， 补肺利水，通调水道，取其“提壶揭盖”之意，上下通 达，攻补兼施，在临床已取得了显著的疗效。本课题 实验旨在发现其作用机制，以利于更好地总结完善。
与模型组比较，*P＜0.05；与正常组比较，#P＜0.05；与阳性药组
比较，△P＜0.05
图 3 中药组大鼠卵巢形态（×20）
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
【摘要】 目的 观察补肾健脾、养血通利中药对于 PCOS 大鼠激素及卵巢形态及卵巢颗粒细胞自噬发生的影响，从而探索中 药治疗 PCOS 的相关作用机制。方法 建立来曲唑诱导 PCOS 大鼠动物模型，灌服中药治疗，并以氯米芬为阳性对照组，与正常 组、模型组进行对照，检测大鼠用药后激素水平、卵巢结构，并应用 MDC 荧光染色及流式细胞术测定大鼠颗粒细胞自噬率的差 别。结果 补肾健脾、养血通利中药能够有效改善大鼠内分泌，可恢复卵巢颗粒细胞数量，抑制颗粒细胞过度自噬。结论 补肾健 脾、养血通利中药可通过改善卵巢颗粒细胞自噬，从而改善卵巢 PCO 状态。
模型组 8 290.25±8.68# 0.537±0.309#△ 70.430±14.490 1.633±0.350 1.490±0.461△
中药组 16 271.69±11.35* 0.082±0.069* 76.533±17.323 1.805±0.454 1.075±0.799
阳性药组 16 282.19±18.98# 0.033±0.021* 91.876±18.274 1.751±0.401 1.109±0.629*
6 周龄雌性 SD 大鼠，体重（200±10）g，购自中 国医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK（京） 2006- 2009。 1.2 试剂
来曲唑 （购自首都医科大学附属北京中医医 院），单磺尸胺 MDC （购自美国 Sigma 公司，CAT.： 30432），羧甲基纤维素 CMC（购自国药集团化学试 剂有限公司，批号：F20070608），中药复方剂（由菟丝 子、杜仲、当归、南沙参、茜草、车前子等组成，生药由 北京中医药大学东方医院中药房提供，并由北京中 医研究所制剂室协助煎煮，过滤，浓缩每 1 mL 相当 于生药 1 g），枸橼酸氯米芬片（塞浦路斯生产，批号
·237·
图 4 阳性药组大鼠卵巢形态（×20）
3.4 各组大鼠颗粒细胞自噬率的比较 各组大鼠的卵巢颗粒细胞自噬率检测，荧光强
度模型组 > 西药组 > 中药组 > 正常组。组间两两比 较，模型组与正常组、中药组、西药组之间均存在显 著性差异（P <0.05），而正常组、中药组、西药组组间 比较，均无显著性差异（P >0.05）。见表 2，图 5～8。
采用 SPSS 19.0 软件包。计量资料以均数±标准 差（x±s）表示，多组间比较以单因素方差分析（OneWay ANOVA）。 3 结果 3.1 各组大鼠体重的比较
模型组大鼠体重明显增加，明显高于正常组，组 间有显著性差异（P <0.01）；阳性药组大鼠体重也有 增加，与模型组比较无显著性差异（P >0.05），与正常 组比较，有显著性差异（P <0.01）。中药组大鼠体重 明显小于模型组，组间比较有显著性差异（P <0.01）， 而与正常组、阳性药组比较均无显著性差异（P >0.05）。 见表 1。 3.2 各组大鼠血清激素水平的比较
通过模型组与正常组大鼠体重、血清激素水平、 卵巢形态学等多方面比较，观察到模型组大鼠比正 常组大鼠体重增加明显；模型组大鼠血清睾酮水平
·238·
北京中医药 2011 年 3 月 第 30 卷 第 3 期 Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine，March，2011. Vol. 30,No.3
3.3 各组大鼠卵巢形态的比较 倒置显微镜下放大 20 倍，观察各组间卵巢形态
学变化，可见模型组大鼠卵泡多数成囊性扩张，可见 囊性窦卵泡，颗粒细胞层数减少，仅有 1- 2 层，且排 列稀疏，黄体组织数量明显减少。正常组大鼠卵泡结 构清晰，颗粒细胞排列整齐均匀，可达到 8- 9 层，大 部分可见卵丘。中药组卵巢可见少许囊性窦卵泡的 出现，可见成熟卵泡，颗粒细胞数较模型组明显增 加，为多层，可见黄体。氯米芬西药组亦可见部分囊 性窦卵泡，颗粒细胞为多层，排列比较整齐，黄体组 织较少。见图 1～4。
使大鼠昏迷后，75 %酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔， 取大鼠卵巢。观察卵巢形态，卵巢体积增大，可见多 个小卵泡，福尔马林固定，制作石蜡切片，HE 染色。 2.4 卵巢颗粒细胞自噬率的测定[2]
无菌取出卵巢，放入生理盐水中清洗 3 遍，体镜 下小心剔除卵巢周围脂肪组织，体镜下用 1 mL 注射 器针头刺破卵泡，PBS 冲洗，用 200 目过滤，800 rpm 离心 5 min，弃上清，用 PBS 将收集的细胞调至浓度 为 1×106·mL-1。0.05 mmol/LMDC 染色，37℃温育 60 min，PBS 清洗后，采用流式细胞仪定量分析其着色 荧光强度（488 nm 激发波长，检测 10000 个细胞），从 而比较各组大鼠颗粒细胞的自噬发生率。 2.5 统计学方法
【关键词】 多囊卵巢综合征；自噬；颗粒细胞；大鼠；补肾健脾、养血通利法；实验研究
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种多发于育龄期 的内分泌失调疾病，是引起女子月经失调、不孕的常 见疾病之一。目前对于 PCOS 的病因仍不明确，中西 医治疗均疗效欠佳。研究表明，颗粒细胞与卵细胞成 熟和排卵密切相关。自噬作为一种新的程序性细胞 死亡方式，与凋亡有着密切的关系，近年来吸引了越 来越多科学家的注意。本课题旨在发现自噬在 PCOS 发生中的作用，了解 PCOS 卵巢颗粒细胞减少的内 在原因，探索补肾健脾、养血通利法治疗多囊卵巢综 合征的作用机制。 1 材料 1.1 动物