蝴蝶兰的组织培养

蝴蝶兰的组织培养

蝴蝶兰[phalaenopsis ]为兰科蝴蝶兰属植物,它是一种热带气生兰,俗称“洋兰”。蝴蝶兰花型似蝴蝶,形态美妙、色彩丰富、花期长,在热带兰中素有“兰花皇后”之美称,。蝴蝶兰种类丰富,分布广,东起菲律宾、新几内亚,南达澳大利亚北部,西苏门答腊,北到我国台湾、云南、四川西部均有原种(野生的蝴蝶兰) 存在,约有50 多种,其中我国有7 种,全部为附生兰。蝴蝶兰商品化大规模栽培十分成功，是近年来在国际花卉市场上最受欢迎的洋兰。从离体器官诱导产生类原球茎，通过类原球茎的增殖培养，得到大量幼苗，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。类原球茎是一类呈珠粒状的幼嫩器官（种子萌发时先是胚的膨大,种皮破裂,一定时间后发育成肉眼可见浅黄色的原胚呈球状,称为原球茎，由其它外植体诱导产生的称类原球茎），在兰科植物中多以这种器官发育、增殖和分化。蝴蝶兰的组培快繁有胚培养、叶片培养和腋芽培养,腋芽培养形成试管苗,再以丛生芽的方式增殖快繁,可以有效地保持母本的优良性状,变异率最低。

1 材料与方法

（1）材料取已过盛花期带休眠芽的花梗作为外植体材料。

（2）材料消毒与接种切下其带芽茎段,长约2 - 3cm ,用自来水清洗干净,在饱和漂白粉上清液中浸泡15 min ,浸泡时不断搅动,浸泡后的茎段用流水冲洗干净,置于超净工作台上,先用75 %的酒精消毒30 s ,无菌水清洗1 次,再用0. 1 %的升汞浸泡10 min ,经无菌水冲洗数次,将带芽茎段接种到经设计的不同激素组合的诱导培养基上,重复3 。

（3）培养基的配制

花梗腋芽诱导培养基为1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L 。

增殖培养基为1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %。

生根培养基为1/ 2MS + BA1. 5 mg/L +NAA0. 3 mg/L + 80 g/L 香蕉泥

以上培养基p H 均为5. 5

2 结果

在培养条件每天光照12 h ,光强1 600Lx ,温度25 ±2 ℃获得以下效果。（1）诱导培养效果：蝴蝶兰花梗接种到不同激素浓度的培养基上,生长1 周后在花梗的基部有褐色物质产生,腋芽开始萌动,1 月后腋芽可以长到1. 5 cm 高，出芽率可达50％。

（2）增殖培养效果：将长出的芽选取约1. 5cm 的苗，取出后切去叶片和基部褐化部分,转接到增殖培养基中,40 d 后，增殖倍数可达到3倍以上。（3）生根培养效果：将高约2. 0 cm 的蝴蝶兰试管苗接种到生根培养基中, 50 d 后，全部生根，平均生根3.5条，长2.5cm。

（4）壮苗培养与驯化移栽：壮苗。生根组培苗壮苗培养基1/2MS+ 蔗糖10g/L+ 琼脂粉3.5 g/L+ 活性炭1.5 g/L ，pH5.4，温度( 25±2) ℃, 光照强度2000Lx, 光照时间14h/d。培养15d 后移栽。驯化：室内开瓶炼苗

3d＋室外炼苗3d。移栽基质：最适合的栽培基质为水苔，椰糠也是良好的移栽基质。

3 讨论

（1）蝴蝶兰和其他兰科植物一样,在组培快繁生产中存在着易褐化死亡的问题,因此如何克服褐变成了组培快繁生产成功与否的关键，活性炭2 g/L ,或PVP 1 g/L效果显著；适时切除培养物的褐化部分并及时更换新鲜培养基，能有效抑制外植体褐变死亡；培养基中加入10%椰子水，也能促进原球茎的生长，减少原球茎增殖过程中的褐变；蝴蝶兰的群体效应很明显，单芽容易褐化死亡，且增殖较慢，因此，刚诱导出的原球茎状体不能过早切割转移，在继代阶段接种时，应尽量避免切成单芽，增殖时切块也不宜过小，否则容易褐化死亡；添加香蕉汁对蝴蝶兰原球茎形成及幼苗生长具有明显的促进作用。

（2）另有报道：①蝴蝶兰原球茎的诱导主要受外植体、培养基和培养条件等因素的共同影响,其中,外植体最难以控制,这与外植体本身的生长发育和生理生化状态有关。因此,对外植体的筛选是组培中较关键的技术。蝴蝶兰组织培养过程中,采用同样培养基处理时,茎尖比叶片、花梗侧芽作为外植体效果较好。②)在激素浓度相同条件下, 1 /2MS、MS、White、B5作为基本培养基均能诱导出原球茎,但MS效果最好,且诱导的原球茎数量多,密度大。③以MS作为基本培养基对蝴蝶兰原球茎进行增殖培养,附加NAA 1. 00 mg/L和6－BA 2. 00 mg/L时,增殖效果最好。④蝴蝶兰生根过程中,在1 /2MS培养基上根生长最快,生根率可达94. 42%,根长可达0. 86 cm,长势最粗壮,数量最多,说明低浓度的盐分有利于侧根发生。⑤基本培养基中添加蔗糖浓度为3%,琼脂为6. 00 g/L,活性炭为1. 00 g/L; pH值为5. 60 ～5. 80;培养温度为( 25 ±1) ℃;光照时间为13h /d;光照强度为1 500～2 000 lx。

（3）组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的有效途径，主要通过两条途径：一是利用种子无菌发芽，二是从离体器官诱导产生原球茎，通过原球茎的增殖培养，得到大量幼苗。早在1949 年，Potor利用无菌培养技术成功地促使蝴蝶兰花梗上的休眠芽发育成完整植株，该方法经过其他研究人员改进后，曾一度成为蝴蝶兰的主要无性繁殖方式。1974 年，Intuwong等利用蝴蝶兰茎尖诱导产生了原球茎状体，再由原球茎分化成植株，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。蝴蝶兰的组织培养中有几个关键的时期：原球茎的诱导、原球茎的继代增殖、壮苗的培育。蝴蝶兰组培的快繁技术，包括外植体的选择、不同基本培养基、激素、添加物对其增殖与分化的影响、外植体褐变的防治以及生根壮苗的方法等。

外植体的选择：诱导蝴蝶兰原球茎采用的外植体主要有根段、花梗苗根尖、花梗腋芽、茎尖、叶片、胚、花葶节间（花葶：地上无茎植物从地表，通常自基生莲座抽出的无叶花序梗）、花梗节或花梗节间切段、种子等。蝴蝶兰不同外植体的成活率有差异，其中花梗侧芽的成活率最高，其次为花梗，叶片和根尖最差。针对不同外植体，取材方法也不同，通常取花梗节之间1～2cm 长的幼嫩部分，切取长2～3mm 的切段作为外植体。如利用2～3cm 长的根尖段，将其切成0.5～0.8cm，接种2 周后根端切口处开始膨大，产