体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证
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目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已经广泛应用。
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37
三种方法的比较：
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38
4.化学衍生化法
将药物进行化学衍生化的目的是：①使药物变成具有能 被分离的性质；②提高检测的灵敏度；③增强药物的稳 定性；④提高对光学异构体分离的能力等。
药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如：-COOH 、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化 。
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39
HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化， 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理 后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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18
②加入中性盐
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋 白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠 、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂 提取法常并用，药物的回收率较高。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
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11
4 尿液
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
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27
方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提 取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提 取效果最好；
若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1 ,1:2 ,1:3的使用；
在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试 着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率；
丁基甲醚和氯仿等。
应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、 有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+
碱性药物的解离：B + H2O
B+ + OH-
药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。
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25
药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药 物，最佳pH值要高于pKa 1-2个单位；对于酸性药物来 说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物 以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。
提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使 用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。
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28
举例：雌二醇的检测
取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷 1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃ 冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解， +50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40℃水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液 2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃ 冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，流动相复溶。
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Байду номын сангаас44
方法学验证（validation）
生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整 个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它 药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依 赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果， 因此必须对所建立的方法进行验证。并且在实际样品检测过 程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品 进行测定，以确保检测方法的可靠性。
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34
根据原理分类：
1.正相色谱原理 2.反相色谱原理 3.离子交换原理
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36
SPE方法的优点：
1.不会发生乳化；2.适用范围广；3.提取效率高； 4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物； 5.溶剂消耗少；6.易于实现自动化； 7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依 据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度 的分离出药物，去除干扰。
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3
2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
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16
实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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17
优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。
血浆蛋白结合率。
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23
2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
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24
有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的 溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔
常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸 或 氨 水、氢氧化钠等。 水相的PH值--影响液液萃取最关键的因素
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26
具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。 优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干
净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩； 大多数药物具有脂溶性，应用范围广。 缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血 浆中的脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会 在离子源处产生基质效应，严重干扰质谱检测结果的准 确性！
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21
④酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用 酶解法。
在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合 物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
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22
其他的一些去除蛋白质的方法：
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
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30
固相萃取的基本原理和方法： SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性 洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相 和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的 色谱过程。
较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测 物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗 脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选 择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。
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4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
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5
二、生物样品的种类
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便 、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
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6
1 全血
全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
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15
1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
3 血清
血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
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10
一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
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43
体内药物的HPLC-MS/MS分析方法开发的一般流程：
1.查阅相关文献资料，了解药物的理化性质，选定内标物质； 2.使用标准品，扫描质谱条件； 3.选择色谱柱和流动相，摸索合适的液相条件； 4.依据样品基质，配制模拟生物样品，选择相应的样品处理
方法，处理后进样分析； 5.调整样品处理方法或液相条件，并可进一步优化质谱参数； 6.根据检测目的，设定定量范围，对方法进行考察。
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19
③加入强酸
当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形 式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强酸 的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
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20
④加入锌盐或铜盐沉淀剂
当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白 质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
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3.固相萃取 SPE
固 相 萃 取 (Solid Phase Extraction，简称SPE) 是从八 十年 代 中期开始发展起来的一项样品前处理 技术。由液固萃取和液相色谱技术相 结合发展而来。主要通过固相填料对 样品组分的选择性吸咐及解吸过程， 实现对样品的分离，纯化和富集。主 要目的在于降低样品基质干扰，提高 检测灵敏度。
13
生物样品的保存：
采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
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14
三、常用的处理方法
主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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40
定量下限达10 pg级别！
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41
体内药物分析方法的建立
➢ 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 ➢ 分析测定的目的与要求 ➢ 生物样品的类型与预处理方法 ➢ 实验室条件
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42
体内药物分析方法大致可归为一下几类：
1. 光谱分析法 2. 色谱法 3. 毛细管电泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法
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7
2 血浆
测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素 、EDTA）的试管中，混合后，3000至 4000 r/min离心，分离血细胞，上清液 即为血浆。
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8
血浆中含有的物质种类和比例
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9
尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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12
5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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31
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32
萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！
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33
固相萃取操作一般有五步：
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
体内药物分析的样品处理 和方法学验证
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1
1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
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2
一、处理的目的
生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物 之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物 、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、 硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存 在，需要分离后测定药物及代谢物。
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三种方法的比较：
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4.化学衍生化法
将药物进行化学衍生化的目的是：①使药物变成具有能 被分离的性质；②提高检测的灵敏度；③增强药物的稳 定性；④提高对光学异构体分离的能力等。
药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如：-COOH 、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化 。
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HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两 种方法。
柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生 化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化， 影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的 ，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。
HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺 等。
缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理 后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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②加入中性盐
中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋 白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠 、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂 提取法常并用，药物的回收率较高。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
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4 尿液
尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
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27
方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提 取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提 取效果最好；
若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1 ,1:2 ,1:3的使用；
在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试 着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率；
丁基甲醚和氯仿等。
应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、 有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+
碱性药物的解离：B + H2O
B+ + OH-
药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。
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药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药 物，最佳pH值要高于pKa 1-2个单位；对于酸性药物来 说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物 以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。
提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使 用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。
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举例：雌二醇的检测
取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷 1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃ 冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解， +50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40℃水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液 2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃ 冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，流动相复溶。
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Байду номын сангаас44
方法学验证（validation）
生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整 个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它 药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依 赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果， 因此必须对所建立的方法进行验证。并且在实际样品检测过 程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品 进行测定，以确保检测方法的可靠性。
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根据原理分类：
1.正相色谱原理 2.反相色谱原理 3.离子交换原理
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SPE方法的优点：
1.不会发生乳化；2.适用范围广；3.提取效率高； 4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物； 5.溶剂消耗少；6.易于实现自动化； 7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依 据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度 的分离出药物，去除干扰。
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2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
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实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。
血浆蛋白结合率。
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2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
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有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的 溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔
常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸 或 氨 水、氢氧化钠等。 水相的PH值--影响液液萃取最关键的因素
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具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。 优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干
净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩； 大多数药物具有脂溶性，应用范围广。 缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血 浆中的脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会 在离子源处产生基质效应，严重干扰质谱检测结果的准 确性！
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④酶解法
在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用 酶解法。
在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合 物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
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其他的一些去除蛋白质的方法：
超速离心法 平衡透析法 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
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固相萃取的基本原理和方法： SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性 洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相 和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的 色谱过程。
较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测 物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗 脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选 择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。
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60%以上精力和花费用在样品前处理上
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二、生物样品的种类
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便 、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
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1 全血
全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
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1.沉淀蛋白
①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
3 血清
血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
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一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
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体内药物的HPLC-MS/MS分析方法开发的一般流程：
1.查阅相关文献资料，了解药物的理化性质，选定内标物质； 2.使用标准品，扫描质谱条件； 3.选择色谱柱和流动相，摸索合适的液相条件； 4.依据样品基质，配制模拟生物样品，选择相应的样品处理
方法，处理后进样分析； 5.调整样品处理方法或液相条件，并可进一步优化质谱参数； 6.根据检测目的，设定定量范围，对方法进行考察。
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③加入强酸
当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形 式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强酸 的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
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④加入锌盐或铜盐沉淀剂
当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白 质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
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3.固相萃取 SPE
固 相 萃 取 (Solid Phase Extraction，简称SPE) 是从八 十年 代 中期开始发展起来的一项样品前处理 技术。由液固萃取和液相色谱技术相 结合发展而来。主要通过固相填料对 样品组分的选择性吸咐及解吸过程， 实现对样品的分离，纯化和富集。主 要目的在于降低样品基质干扰，提高 检测灵敏度。
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生物样品的保存：
采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
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三、常用的处理方法
主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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体内药物分析方法的建立
➢ 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 ➢ 分析测定的目的与要求 ➢ 生物样品的类型与预处理方法 ➢ 实验室条件
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体内药物分析方法大致可归为一下几类：
1. 光谱分析法 2. 色谱法 3. 毛细管电泳法 4. 免疫分析法 5. 同位素法
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2 血浆
测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素 、EDTA）的试管中，混合后，3000至 4000 r/min离心，分离血细胞，上清液 即为血浆。
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血浆中含有的物质种类和比例
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尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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5 唾液
唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！
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固相萃取操作一般有五步：
活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
体内药物分析的样品处理 和方法学验证
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1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
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一、处理的目的
生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物 之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物 、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、 硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存 在，需要分离后测定药物及代谢物。