基因表达研究技术

1、基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）
是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。

任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。

2、原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。

3、RNA原位杂交：用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。

4、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。

5、基因定点突变(site-directedmutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。

6、基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。

7、基因敲除分为：
完全基因敲除：是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性
条件型基因敲除：（又称不完全基因敲除），是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。

8、酵母单杂交系统（Yeast one-hybridsystem）是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。

将已知顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游。

将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域（transcription-activating domain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。

9、酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。

BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。

10、Far Western印迹技术：用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。

11、GST融合蛋白沉降技术：利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。

12、蛋白质芯片技术：蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。

将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。

14、等离子表面共振技术：将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。

当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。

15、免疫共沉淀技术：将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。

16、荧光共振能量转移法（FRET）：FRET荧光能量转移有三个基本条件：
（1）给体与受体在合适的距离（1～10nm）；
（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；
（3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。

FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。

不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。

17、RNAi（RNA interference,RNA干涉）：RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。

研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。

经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标mRNA。

siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。

由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。

18、基因芯片（DNA chip）：又称DNA微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。

把大量已知或未知序列的DNA片段点在尼龙膜或玻璃片上，再经过物理吸附作用达到固定化。

也可以直接在玻璃板或金属表面进行化学合成，得到寡聚核苷酸芯片。

将芯片与待研究的cDNA或其他样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到成千上万个基因在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。

19、利用酵母鉴定靶基因功能：
酵母菌是单细胞真核生物，具有与动植物细胞相似的结构特征。

酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组DNA全序列测定的真核生物。

导入酵母细胞中的DNA即能以自主复制的分子形式存在，也可被整合到基因组的方式存在。

酵母中转化DNA的整合重组主要通过同源重组方式进行，整合效率较高。

20、外源基因在酵母中的功能鉴定：将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因的生物学功能。

21、凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobilit shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。

如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。

22、噬菌体展示技术：基本原理是将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。

重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。

23、蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。

该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。

24、核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。

某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。

将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。

25、核酸的分子杂交技术：在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA 分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。

常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；
2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。

所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。

26、细菌转化：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。

这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA
的寄主菌株则称做受体菌株。

大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。

在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。

Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。

27、DNA序列分析：
a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。

②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。

在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。

b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程)
用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA 片段能在激光诱导下发出荧光。

按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。

28、基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）：使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。

如：盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。

29、利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究. ：
a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。

b．DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）
主要步骤：
①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；
②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；
③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。

这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！
④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；
⑤进行DNA凝胶分析。

如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。

在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。

30、PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。

①.高温变性
在高温（93-95℃）下，待扩增的双链DNA模板受热变性成为两条单链DNA模板。

②.低温退火
在低温（37～60℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链。

③.适温延伸
在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物3’-OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料，按5’→3’方向延伸,合成单链DNA模板的互补链。

31、基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA 中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。

32、基因克隆：是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。

33、基因文库的构建的步骤:
①载体DNA的分离
②真核生物DNA的分离
③部分酶解
④片段回收(9-23 kb)
⑤载体与插入片段的连接
⑥包装
⑦文库的效价测定
⑧文库的扩增
⑨文库的保存
⑩重组克隆鉴定。