氯霉素及分析方法

1 绪论

1.1 引言

随着社会经济的快速发展和人民生活水平的提高，动物源性食品在人们生活中所占比例越来越大，部分不法养殖户为追求经济效益最大化，不同程度的在饲料中添喂人用抗生素，使畜禽肉品中抗生素残留严重，成为的食品安全的重要问题之一。各国政府严格限制食品中各种有害成分，特别是抗生素、农药残留等。

食品安全检测是保障食品安全的基础，是监督管理的重要手段。为了有效地保障食品安全，就必须对食品安全中的各类样品进行准确地分析测定。目前食品安全检验部门通常采用气相色谱、液相色谱等分析仪器。然而使用这些仪器进行分析测定前，必须把样品制成溶液。

由于食品样品具有被测物浓度低、组分复杂、干扰物质多、易受环境影响而变化等特点，因此要获得数据准确、重现性好的分析结果，样品预处理是重要环节。样品预处理已成为分析化学领域中一个重要的分支，传统的样品预处理方法有液-液萃取、索氏提取、层析、蒸馏、吸附、离心、过滤等几十种。这些方法一般要使用大量的有机溶剂，而且处理时间长、操作步骤复杂，容易导致样品损失和玷污，产生较大误差。因此，迫切需要探索高准确度、快速、简单、不使用或少使用有机溶剂的样品预处理方法，发展较快的有固相萃取、固相微萃取等。

固相萃取技术以其高效性、高选择性、高自动化程度以及低耗性等特点被广泛地应用在生物医学、食品分析、环境分析等领域[1]，其关键是优良的固相萃取材料的制备。因此制备选择性高的固相萃取材料已为研究的热点。

1.2 氯霉素样品预处理及检测方法

1.2.1 氯霉素类抗生素来源及危害

我国是一个养殖大国，近年来养殖业飞速发展。由于集约化的高密度养殖、珍贵品种引进、使用催生长激素、环境污染等因素导致了养殖环境的恶化和畜禽疾病增加，又由于畜禽疾病防治体系的不健全和欠缺用药指导和规范管理，在养

殖业中滥用抗生素现象严重。比如不遵守休药期、超剂量使用、超范围使用违反国家法规规定等等，从而造成动物源食品中的抗生素的残留。这部分残留抗生素就转移到了人们体内，这会使人产生对抗生素的抗性，从而影响以后用药的效果。

CAP广泛用于各种传染性疾病的治疗，通过抑制细菌蛋白质合成而发挥抑菌作用，对大多数革兰氏阳性和阴性菌有效，对革兰氏阳性菌作用性较强，特别是对伤寒副伤寒杆菌作用最强。但CAP对人体存在严重的毒副作用，主要是抑制骨髓造血功能，引起粒细胞和血小板减少以及再生障碍性贫血；除此以外对消化系统神经系统也有严重的毒性反应，可引起视神经炎、急性中毒性表皮松懈症、角膜瘫痕、皮疹等不良反应，对新生儿、早产儿、老年人以及肝肾功能不全的病人影响更大[2]。近年有儿童服用CAP和老年人使用CAP眼膏导致死亡事件的报道。CAP的应用已有近50年的历史，但由于上述毒副作用使CAP成为第一个被禁止用于可食用动物的抗生素。

CAP在动物性食品中的残留严重威胁着人类健康，因此CAP残留问题已引起国际组织和许多国家及地区有关部门的高度重视。欧盟均在法规中规定CAP 残留限量标准为“零容许量”[3]，即不得检出。美国仅允许CAP用于非食用动物，FDA规定的CAP检出限为0.3 ng/ml，而且目前正在研究应用更灵敏的检测方法[4]。我国农业部已将CAP从2000年版的《中国兽药典》中删除，作为禁用药品。在2002年底的农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中明确规定CAP 在动物性食品中不得检出，对于用酶联免疫（ELISA）和高效液相色谱分析法（HPLC）检测时要求其检测限量为1 ng/mL。

1.2.2 样品预处理方法

1.2.2.1 固体样品预处理方法

固体样品的预处理方法通常有索氏提取、超声萃取、微波辅助萃取等，近几年发展了一种新的绿色预处理技术—亚临界水萃取。

1）索氏提取

索氏提取（Soxhlet Extraction，SOX）利用虹吸原理，保持提取溶剂与提取样品充分反应，因而消除了振荡提取中的传质不平衡，其设备花费低、提取样品范围广、且易于操作，迄今仍被广泛应用。但索氏提取技术需要较长提取时间

( >18h)，受提取物干扰影响较大，提取过程需要消耗大量溶剂，大量的提取溶剂不仅花费高而且对环境造成新的污染，因而此技术不宜于批量处理样品。

2）超声萃取

超声波是一种弹性机械振动波，它的强烈振动产生高速度、强烈的空化效应，从而引起的剧烈机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应和热效应等，加速被萃取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，从而缩短了萃取时间，提高了萃取效率。超声萃取（Ultrasonic Extraction）设备简单，技术成熟，对被萃取物基本上没有选择性差异，可作为一种通用型的萃取方法。

Aleixo等[5]将超声萃取技术用于食品中铅和镉的萃取。他们将待测样品粉碎后加入适量硝酸，超声处理5～10min后离心，并用原子吸收进行了分析。实验结果表明条件优化后的超声萃取对蔬菜和动物组织中铅、镉的回收率可达89%～105%。超声萃取具有快速、价廉、高效的特点，与传统的索氏萃取相比，耗时短，溶剂用量少，设备简单，操作容易。但是超声萃取过程中超声波有可能破坏某些分析物，且仪器保养要求高。

3）微波辅助萃取

微波辅助萃取（Microwave-assisted Extraction，MAE）是80年代才发展起来的一项新型分离技术，微波是一种频率范围在300-300,000兆赫的电磁波，常用范围为2450兆赫，即微波产生的电场正负讯号每秒钟可以变换24.5亿次。极性分子在微波电场的作用下，以每秒24.5亿次的速率不断改变其正负方向，使分子产生高速的碰撞和摩擦而产生高热，从而加速了两相间的传质过程，升温快速而均匀，使溶剂萃取时间大大缩短。T.H.Hoang等[6]采用MAE技术从各种固体剂中提取有效药物成分，以甲醇-水（75：25，V/V）为萃取溶剂，50 ℃的条件下萃取5 min，得到有效成分的回收率为97.4~101.9%。

4）亚临界水萃取

亚临界水萃取（Subcritical Water Extraction，ScWE）是一种新的绿色样品预处理技术，其设备简单、萃取时间短，通过改变亚临界水温度和压力来改变水的极性、表面张力和粘度，从而可以选择性地萃取样品基体中的不同极性的有机化合物，甚至金属离子。由于采用纯水作萃取剂，不用或很少用有机溶剂，因此它对环境没有污染或污染很少。Yu Yang等[7]研究了用亚临界水萃取工业污染土壤

样品和美国河流沉积物样品中的PCBs的条件，回收率能达到90%以上。Omid tavakol等[8]用ScWE技术从鱿鱼排泄物内分别萃取Cd（Ⅱ），Cu（Ⅱ），Zn（Ⅱ），萃取温度分别为380 ℃，300 ℃，240~300 ℃，萃取压力分别为1.55 MPa，3.35 MPa，6.42 Mpa，萃取时间分别为20 min，20 min，10 min。

1.2.2.2 液体样品预处理方法

液体样品的预处理方法主要液-液萃取、固相萃取法、固相微萃取等。

1）液-液萃取

液液萃取（liquid-liquid Extraction，LLE）是利用溶质在两种不相溶或部分互溶的液相之间的分配不同来实现溶质之间的分离或提纯。由于它具有选择性高，分离效果好，易于实现大规模连续化生产的优点，在有色金属湿法冶金、化学分析等领域中得到应用[9,10]。但此技术在实际应用中存在溶剂损失、处理时间长、二次污染、易燃、有气味等缺点。

2）固相萃取、固相微萃取

固相萃取技术（SPE）是一种液固分离萃取的试样预处理技术，其装置图如图1.1所示。它是根据被萃取组分与样品基质及其他成分在固定相填料上作用力强弱的不同而使它们彼此分离。通过颗粒细小的多孔固相吸附剂选择性的吸附溶液中的被测物质，被测物质被定量吸附后，用体积较小的另一种溶剂洗脱或用热解析的方法解析被测物质，从而达到分离富集被测物质的目的。固相微萃取（SPME）是在固相萃取技术的进一步发展，装置图如1.1所示。该技术克服了固相萃取技术的缺点，如固体或油性物质对填料空隙的堵塞等，大大降低了空白值，同时又缩短了分析时间。该技术操作简单，可以节省样品预处理70%的时间，无需使用有机溶剂，极大的改善了操作人员的工作环境，使有毒溶剂降到最低。

固相萃取技术的关键是固相萃取柱的填料。SPE柱使用最多的填料C18相。该种填料疏水性强，在水相中对大多数有机物显示保留。也使用其他具有不同选择性和保留性质的填料，如活性炭纤维、氧化铝、硅酸镁、C8、离子交换剂等[11]。近年来，发展了许多专属性SPE固定相，是针对特定的环境、生物试样而设计的，例如用分子印迹聚合物（MIP）作为固相萃取材料[12-14]。

a b

图1.1 装置示意图. a. 固相萃取b. 固相微萃取

1.2.2.3 氯霉素样品预处理方法

CAP样品的预处理方法目前主要有液-液萃取、振荡萃取、超声萃取以及亚临界水萃取等。

蜂蜜等液体样品主要采用液-液萃取。液-液萃取[15]是将取适量的蜂蜜等液体试样放入烧杯中，45 ℃水浴加热5 min，加入乙腈进行离心5 min，再加入氯仿离心3 min，取上清液，蒸干有机剂，用乙腈溶解。

小虾、饲料等固体样品可以采用超声萃取、振荡萃取及亚临界水萃取等方法。振荡萃取[16]是将固体试样绞碎后，加入适量的乙酸乙酯和水放在振荡器上振荡3 min静置，过滤，将残渣再次振荡、静置、过滤，反复提取3次，滤液合并放入分液漏斗中，去除下层保留酯相，浓缩蒸干，用乙醇溶解。超声萃取[17]是将试样中加入乙酸乙酯，超声萃取一段时间后，水浴蒸干乙酸乙酯，用氯化钠－甲醇溶液溶解。亚临界水萃取[18]是取适量样品放入小硬质管中，萃取温度105 ℃，萃取时间10 min，溶剂酸度为中性，溶剂体积为去离子水5 mL。

近几年来随着分子印迹技术的发展，CAP分子印迹聚合物在食品残留检测中的应用也成为研究热点。

1.2.3 氯霉素的检测方法

氯霉素残留的分析检测方法多用微生物学方法、放射免疫法、色谱法和酶免疫分析法等。

（1）微生物学方法

微生物学方法是CAP测定的最常用的方法[19]。该方法易操作，费用低，可用

于大量样品的筛选。该方法是用拭子采集动物体内的组织液，然后将其放置于涂满枯草杆菌的培养基中，保温过夜。观察在拭子周围是否出现抑菌环，若有即表明组织液中有大量抗生素存在，如果该动物用过CAP进行治疗，则可以认为该组织中存在CAP残留。

微生物法的优点是操作简便、样品用量少、预处理简单，在基层大规模筛选中有一定的应用价值；缺点是微生物法检测周期较长，易受组织中其他抗菌素影响，特异性低，灵敏度也不高。

（2）放射免疫法

放射免疫分析是建立在免疫反应基础上的核技术，最基本的原理是放射性核素标

记的抗原和被测抗原（或标准品）对有限量的抗体进行可逆性的竞争结合反应。Amold 等[20]报道了在蛋、肉、奶中CAP的放射免疫痕量分析。对于用CAP治疗的动物组织和其它可食用产品，此方法检出限量约为0.2 ng/ml，1 ng/ml以上的CAP残留能被准确定量，在蛋、肉中平均回收率为85%，在奶中回收率高于95%。

放射免疫法的检测灵敏度较高，但是具有同位素半衰期短、存在放射性污染及需要复杂的仪器设备等缺点，使应用受到限制。

（3）酶联免疫分析法

酶联免疫测定法是以酶学和免疫化学为基础发展起来的一种新技术。其原理是试样中残留的CAP与试剂盒中的CAP酶标记物共同竞争CAP抗体，形成有酶标记或无酶标记的抗原抗体复合物而被吸附于微孔板底，用酶标仪在450 nm处测定吸光度，根据吸光度值得出样品中CAP的残留量。由于该技术灵敏度高、特异性强、快速经济，已在许多领域中得到广泛应用。现已有试剂盒供应市场，可以直接用于样品检测，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一。

Van de Water 等[21]采用单克隆抗体竞争酶联免疫法测定猪肌肉组织中CAP

残留，最低检测限量可达25 ng/mL。Keukens 等[22]用La Carte Test试剂盒检测肉中的CAP残留，最低检测限为2 ng/ml。

但是ELISA的缺点在于影响因素较多，易出现大量假阳性结果。抗体批次不同，测定结果也会出现差异。

（4）色谱法

气相色谱法具有分离效能高、选择性高和灵敏度高的特定，加上检测快速，因此应用广泛。CAP的分子结构中含有氯，故可以选用高灵敏度的电子捕获检测器。2004年林秋萍等[23]建立了鸡肌肉中CAP残留量的气相色谱测定方法，结果表明其方法的线性范围在10-200 ng/ml之间最小检出限是1.1 ng/mL。

CAP含有苯环、羟基基团等可以使CAP在紫外光下有很强的吸收，可以应用高效液相色谱法紫外检测器对其进行定性定量检测。高效液相色谱法检测CAP 是一种灵敏度较高、可靠性较强的一种方法，此法重复性好、假阳性少，但检测限较高，为5.0-10 μg/kg。由于动物源性产品成分复杂，一些杂质干扰测定，应用该法检测时，对于样品预处理必须仔细谨慎，以提高测定准确性和灵敏度。1992年Nagata 等[24]报道了用液相色谱法同时测定动物肌肉中的甲砜霉素和CAP的残留方法。

目前，我国国家标准方法有气相色谱法测定饲料中CAP[17]，和水产品中CAP 残留[25]。色谱法具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等优点，是目前国际公认的测定方法。但是，它也存在一些明显的不足，如：仪器化程度高且价格昂贵，要求具有较高专业素质的熟练人员操作等。因此不能用于现场监控分析，也不适用于大量筛选。