人血清白蛋白的提取纯化和分子量测定教学文案
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奈氏试剂是络盐K2[HgI4]加KOH的溶液，在无机化学定性分析中，用其 检验氨或铵盐
➢ 血清白蛋白
血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定， 能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持 血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代 谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在 医学临床及生物领域应用广泛。可以根据不同蛋白质的相对 分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分 离及提纯各种蛋白质。
The experimental steps
I. 血清白蛋白的初步分离 II. 血清白蛋白的纯化 III. 血清白蛋白相对分子量的测定
血清白蛋白的初步分离
1. 取样 取2ml血液，4℃，3000rpm离心15min，移取上清液（血清）1ml至10ml离心管。 2. 盐析 ①量取9ml50%的饱和硫酸铵溶液，以移液管逐滴加入，同时不断振荡，4℃静置2h。 ②4℃，3000rpm离心15min，收集上清液。 ③用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（即白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体 积，确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）。 ④逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h。 ⑤4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲 液溶解。
Ⅱ.血清白蛋白的纯化：DEAE－纤维素阴离子交换剂
离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。 本实验采用的是DEAE－纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨 基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力 取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换 剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在 0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析 柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β 球蛋白（血清白蛋白等电点为4.5，绝大多数，α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着 盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下 来。
血清白蛋白的纯化——离子交换层析
① 装 柱 ： 将 层 析 柱 固 定 ， 保 持 垂 直 位 。 将 浸 胀 的 DEAE- 纤 维 素 装 入 柱 内 ， 至 810cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。 ②准备50-100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节 流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零。 ③上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓 冲液，使样品完全进入胶内。 ④洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲 液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品。
该法测定蛋白质分子量的局限性：
1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只 是它们的亚基或单条肽链的MW。 2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。 3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。 4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。
03
实验步骤
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定：SDS－PAGE法
SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋 白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一 样，则电泳迁移率只与分子量有关。
SDS的作用： 1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能 使二硫键断裂，使蛋白质完全变性； 2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异； 2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定：SDS－PAGE法
在 一 定 范 围 内 ， 蛋 白 质 的 迁 移 率 和 分 子 量 的 对 数 呈 线 性 关 系 ， 符 合 下 式 ： logMW=K-bx （MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数） 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
血清白蛋白的初步分离
3. 透析 ①将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在。 ②NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏 试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存在， 需继续透析。
➢ 盐析
广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐 使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下， 蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏 了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并 不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度， 蛋白质就可以重新溶解。
白质的原理与操作； 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的
原理和方法。
Βιβλιοθήκη Baidu2
实验原理
The experimental principles
Ⅰ.血清白蛋白的初步分离
在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋 白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多， 故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。
人血清白蛋白的提取纯化 与分子量的测定
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目录
Contents
11
实验目的及意义
22 实验原理
33 实验步骤
44 预计实验结果呈现形式
55
可能结果偏差及解释
66
实验重点与难点剖析
01
实验目的及意义
The experimental purpose and meaning
掌握血清白蛋白分离纯化的方法； 学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋
➢ 血清白蛋白
血清白蛋白约占血浆蛋白总量的60%，水溶性很强，结构稳定， 能结合多种小分子，如脂肪酸，胆红素，血红素等，起维持 血液的正常渗透压作用。此外白蛋白还有解毒、参与脂类代 谢及血浆中微溶物质的运输、维持血液酸碱平衡等作用，在 医学临床及生物领域应用广泛。可以根据不同蛋白质的相对 分子质量、溶解度以及在一定条件下带电的情况的不同来分 离及提纯各种蛋白质。
The experimental steps
I. 血清白蛋白的初步分离 II. 血清白蛋白的纯化 III. 血清白蛋白相对分子量的测定
血清白蛋白的初步分离
1. 取样 取2ml血液，4℃，3000rpm离心15min，移取上清液（血清）1ml至10ml离心管。 2. 盐析 ①量取9ml50%的饱和硫酸铵溶液，以移液管逐滴加入，同时不断振荡，4℃静置2h。 ②4℃，3000rpm离心15min，收集上清液。 ③用5%的柠檬酸缓冲液调节pH至4.5（即白蛋白的等电点），用量筒确定上清液的体 积，确定上清液的体积，计算加入饱和硫酸铵（pH＝4.5）的体积（0.11×V）。 ④逐滴加入饱和硫酸铵（pH＝4.5），边加边振荡，4 ℃静置2 h。 ⑤4 ℃，3,000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用0.5 ml pH 7.4的柠檬酸-Na2HPO4缓冲 液溶解。
Ⅱ.血清白蛋白的纯化：DEAE－纤维素阴离子交换剂
离子交换层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析方法。 本实验采用的是DEAE－纤维素阴离子交换剂（中强碱型），可电离基团是二乙基氨 基乙基，适用于大分子的分离。在离子交换层析中，蛋白质对离子交换剂的结合力 取决于彼此之间相反电荷基团的静电吸引，而这又和溶液的pH与盐离子浓度有关。 因此，蛋白质混合物的分离可以由改变溶液中盐离子浓度和pH来完成，对离子交换 剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。除硫酸铵后的白蛋白溶液在 0.02mol/L pH7.4 醋酸铵缓冲液的条件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纤维素层析 柱上，在此pH 时，DEAE 一纤维素带有正电荷，它能吸附带负电荷的白蛋白、α及β 球蛋白（血清白蛋白等电点为4.5，绝大多数，α及β球蛋白等电点均小于6 ）。随着 盐离子浓度的提高，离子交换柱上的β－球蛋白、α－球蛋白、白蛋白依次被洗脱下 来。
血清白蛋白的纯化——离子交换层析
① 装 柱 ： 将 层 析 柱 固 定 ， 保 持 垂 直 位 。 将 浸 胀 的 DEAE- 纤 维 素 装 入 柱 内 ， 至 810cm高度，平衡过夜（装柱时应注意均匀，凝胶内不得有气泡，凝胶床要平整）。 ②准备50-100支试管，置于自动收集器上；洗脱液经核酸蛋白检测仪监视，调节 流速为 1mL/min，蛋白质检测器调零。 ③上样：将透析袋剪开，用移液管转至凝胶面上，待样品进入凝胶后再加入少量缓 冲液，使样品完全进入胶内。 ④洗脱：采用连续梯度洗脱。接上恒流泵，用0.02～1.0mol／L醋酸－醋酸铵缓冲 液（pH7.4）进行梯度洗脱，收集；记录出现峰值的管号；保存样品。
该法测定蛋白质分子量的局限性：
1.蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，测定时只 是它们的亚基或单条肽链的MW。 2. 电荷异常的蛋白质（如组蛋白，带大量正电荷）。 3.结构异常，不于分子量呈线性关系（如胶原蛋白）。 4.带有较大辅基的蛋白质（如糖蛋白）。
03
实验步骤
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定：SDS－PAGE法
SDS－PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋 白质分子量。 电泳迁移率与颗粒的电荷、形状、大小（分子量）有关，如电荷、形状都一 样，则电泳迁移率只与分子量有关。
SDS的作用： 1.能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂（巯基乙醇）能 使二硫键断裂，使蛋白质完全变性； 2.能与变性的蛋白质按比例结合，形成SDS-蛋白质复合物。 SDS-蛋白质复合物的特点：1. 由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异； 2.复合物都是椭圆棒状，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的形状差异。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。
Ⅲ.血清白蛋白相对分子量的测定：SDS－PAGE法
在 一 定 范 围 内 ， 蛋 白 质 的 迁 移 率 和 分 子 量 的 对 数 呈 线 性 关 系 ， 符 合 下 式 ： logMW=K-bx （MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数） 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋 白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
血清白蛋白的初步分离
3. 透析 ①将剩余的0.4 ml蛋白质溶液将透析袋中，放入pH 7.4的柠檬酸Na2HPO4缓冲液中，搅拌透析过夜至蛋白质溶液中无NH4＋存在。 ②NH4＋的检测（奈氏试剂检测）：取1 ml透析液，加入5滴奈氏 试剂，混匀，观察，如果出现砖红色沉淀，说明仍有NH4＋存在， 需继续透析。
➢ 盐析
广泛使用的分离蛋白质的方法，所谓的盐析就是用大量中性盐 使蛋白质从溶液中析出的过程。在高浓度的中性盐影响下， 蛋白质分子的水化膜被剥夺及所带的电荷被中和，因而破坏 了蛋白质溶胶的稳定因素，使蛋白质沉淀析出。但中性盐并 不会使蛋白质变性，因此，若除去中性盐或减低盐的浓度， 蛋白质就可以重新溶解。
白质的原理与操作； 掌握SDS-PAGE凝胶电泳测定蛋白质分子量的
原理和方法。
Βιβλιοθήκη Baidu2
实验原理
The experimental principles
Ⅰ.血清白蛋白的初步分离
在半饱和硫酸铵溶液中，血清白蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后白蛋 白主要在上清液中。由于血清白蛋白的相对分子质量较硫酸铵大得多， 故盐析初步分离的白蛋白可用透析法或凝胶层析法除去硫酸铵。
人血清白蛋白的提取纯化 与分子量的测定
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Contents
11
实验目的及意义
22 实验原理
33 实验步骤
44 预计实验结果呈现形式
55
可能结果偏差及解释
66
实验重点与难点剖析
01
实验目的及意义
The experimental purpose and meaning
掌握血清白蛋白分离纯化的方法； 学会用盐析和离子交换柱层析法分离纯化蛋