第三章 基因工程载体

表达载体与克隆载体的区别


Hale Waihona Puke 强启动子，一个可诱导的强启动子可使外源基因 有效的转录 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有 一个好的核糖体结合位点序列（SD序列），促进 蛋白质翻译 在外源基因插入序列的下游区要有一个强转录终 止序列，保证外源基因的有效转录和mRNA的稳 定性
表达型载体（expression vector）
Apr TcS为重组子 Apr Tcr为原载体 ApS Tcr为重组子 即为非重组子
pUC系列的质粒载体



pBR322质粒的复制起点 Amp抗性基因，但核苷酸序列不含有原来限制 性核酸内切酶的单一酶切位点 大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其 编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ‘基 因 位于lacZ'基因中的靠近5”端的一段多克隆位点 (MCS ，multiple cloning sites)区，但它 并不破坏该基因的功能

4、
去除两 个PstI
pBR318 （6.3Kb)
酶切 体外重组 酶切
pBR313
EcoRII片 断去掉
pBR322 (4.3Kb)
pBR320 (2.8Kb)
四、常用质粒载体类型

1、克隆质粒载体
2、表达质粒载体


3、多功能质粒载体
4、穿梭质粒载体
1、克隆质粒载体

克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片断无性繁
pBR322插入失活效应
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
Amp r
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入
Tc
有DNA插入
Amp r Tcr
转化
Amp r
Tc s
外源DNA
Amp r Tcr
无菌落 筛选重组子 阳性菌落
Amp r Tc s
提取DNA 电泳
Amp r Tc s
重组DNA
利 用 抗 生 素 抗 性 基 因 筛 选 重 组 子 的 过 程
因区段的β—半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种 互补现象叫做α—互补。

具有多克隆位点MCS区
• pUC质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点 • 具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段， 无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上
pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原
• 在能达到预期目的的前提下，构建质粒克隆载体的构 建过程力求简单。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建

pBR322的构建是质粒载体构
建的一个典范。

pBR322的亲本质粒
• pSF2124，含有Amp抗性基因
• pMB1，含有松弛型ColE1的复制
起点（ori） • Psc101，含有Tet抗性基因
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制

控制复制引物与模板的结合
RNA II
复制方向
5’ 3’
3’ 5’ RNA I
ori （+）
rop Rop
E.coli ColE1 plasmid
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制

控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
外源DNA 有DNA插入
Apr
转化
Ap r
Ap r
筛选重组子 白色菌落
Apr
提取DNA 电泳
重组DNA Ap r
2、表达质粒载体

是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质 的质粒载体
• 根据表达的蛋白是否分泌到细胞外：非分泌型表达载 体（胞内表达载体）和分泌型表达载体 • 根据表达所用的受体细胞：原核细胞表达载体和真核 细胞表达载体
• ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 • p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容

质粒迁移

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个 细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等
殖的质粒载体。
• pBR322质粒
• pUC系列的质粒载体
pBR322质粒

具有较小的分子量，大小4363bp
• 可以克隆大到6Kb的外源DNA片断

具有两种选择标记，即Ampr和Tetr。 具有多种限制性核酸内切酶的单一酶切位点
• Amp抗性基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，Tet抗性基因可被 BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。

在宿主细胞内具有较高的拷贝数。
• 一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件 下，可达到1000-3000拷贝，如氯霉素。
CAP protein binding site 591-554 (compl. strand); mRNA (LacZ) starts at nt position 507 (compl. strand); lac repressor binding site 507-487 (compl. strand).
BamHI片段(Tcr)
pBR322
PstI(Apr)片段 重组分子Ⅱ(Aps Tcr) PstI片段 重组分子I (Apr Tcs）
外源DNA
BamHI片段 重组分子I 重组分子Ⅱ 涂布Ap平板 Apr转化子 Tcr转化子
分别转化E.coli (ApS TcS)
涂布Tc平板
影印到Tc平板上 影印到Ap平板上
• 非接合型质粒 R的其它成员

不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、
值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型 质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定
携带特殊的遗传标记

野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，
这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
载体的功能

运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力


为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
载体应具备的条件

在克隆载体DNA分子合适的位置有一至 多个克隆位点，供外源DNA片段组入克 隆载体DNA分子。 至少有一个复制起点，因而至少可在一 种生物体中自主复制。 至少应有一个遗传标记基因，以指示载 体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 克隆载体必须是安全的。
4、构建的质粒克隆载体DNA分子尽可能小。
5、根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中组装各种 “元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆 载体。
三、质粒克隆载体的构建

质粒克隆载体的设计和构建过程的原则
• 选择合适的出发质粒（亲本质粒）。 • 正确获得构建质粒克隆载体的元件。 • 组装合适的选择标记基因。 • 选用合适的启动子。
一、质粒的一般生物学特性





质粒是细菌染色体外能够自主复制的 环形双链的DNA分子 在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共 价闭合环DNA分子（ccc-DNA）的 形式存在。 在体外理化因子作用下，质粒可以成 为开环DNA分子（oc-DNA）或线形 DNA分子（l-DNA）。 在变性条件下，质粒可成为单链DNA 分子（ss-DNA）。 质粒DNA分子大小1-100Kb以上。
载体的功能及特征
一、发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如 pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al) 2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点 区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 3. 第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同 要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表 达型载体及各种探针型载体。
大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生 质粒克隆载体的构建

1、在菌体内将R1drd19质粒（沙门氏菌中R1质 粒的一种变异体）的易位子Tn3（携带有Amp抗 性基因）易位到pMB1质粒上，构成一个较大的 质粒pMB3(13.3Kb)。 pMB3 AATT黏性末端环化 导入 EcoRI* 大肠杆菌 pMB8(2.6Kb)


2、从质粒pSC101获得四环 素抗性基因（Tetr)。 获得pMB9（5.3Kb)



3、向pMB9引入Amp 抗性基因。 pSF2124的Tn3体内易 位至pMB9获得 pBR312 (10.2Kb,具有 Amp抗性基因和Tet抗 EcoRI* 性基因） pBR312 pBR313 (8.8Kb，除去 Amp抗性基因中的 BamHI位点）
Cop
Rep
Pco
p
co
p
P/Orep
re
p
ori
质粒的不亲和性

有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下， 两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细 胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中 必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质 粒称为不亲和质粒。
以大肠杆菌的质粒为例：
• 物质抗性 • 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱

这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒载体
二、构建质粒克隆载体的基本策略

1、能在转化的受体细胞中进行有效的复制，并有较多 的拷贝。
2、含有尽可能多的克隆位点。



3、含有供选择克隆子的标记基因。
终止子（常称之为表达分泌型载体）
ATG I II III IV
成熟蛋白质 CS
TAA V
转录终止区
转录起始 翻译起始 信号肽
I II III
CS--cloning site
I
CS
V
I
II ATG
质粒DNA的复制


质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 复制方向性：纯单向性（ColEI）；纯双向性（F质粒）； 既有单向又有双向性（R6K）。 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分 为两大复制类型：
• 严紧型复制控制的质粒 1 – 数个 拷贝 stringent plasmid • 松弛型复制控制的质粒 10 个 拷贝以上 stringent plasmid
Multiple Cloning Sites pUC18
pUC19
pUC系列质粒载体的优点

具有更小的分子量和更高的拷贝数
• pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp • pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，导致rop基因 的缺失

适用于组织化学方法检测重组体
• LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基
理
pUC18/1 9
5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳 糖苷
Plac MCS
lacZ’
b
a
b-半乳糖苷酶的a-肽段
XCH 2OH O HO H O OH H H H H OH N
gal
Cl Br
Cl Br
O N N Cl Br
Ap r
1)限制酶切
利 用 菌 落 颜 色 筛 选 重 组 子
2)DNA重组 无DNA插入
第三章 基因工程载体
基因克隆载体


要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生 物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生 物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具 就是运载体。 基因克隆载体(DNA克隆载体)：通过不同途径 能将承载的外源DNA片段(基因)带入受体细胞， 并在其中得以维持的DNA分子。

特点
• • • • 基因的启动子序列和终止子序列 一般无检测标记基因 克隆位点是确定的（即位于启动子序列后） 重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。

结构
• 转化单元--宿主细胞转化 • 表达单元--外源基因表达
表达型载体（expression vector）

类型
• Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+ 终止子 • Ⅱ型: 转录起始区终止子 + 翻译起始区（核糖体结合 序列和起始密码子）+ 终止子 • Ⅲ型: 转录起始区 + 翻译起始区 + 信号肽链编码区 +
Pvu I Pst I
EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I Apr Tcr


pBR322 4363 bp
ROI ROP Origin of Replication Hind II
Sal I

Bal I
第一节 质粒克隆载体
一、 质粒的一般生物学特性



发现：细菌，偶见于链霉 菌和酵母 独立于染色体之外进行复 制和遗传,又依赖于宿主 编码的酶和蛋白质来进行 复制和转录。• 比病毒还简单的亚细胞结 构，一旦离开寄主细胞则 无法繁殖。