衣霉素抑制细胞周期蛋白D1表达而强化TRAIL诱发凋亡的实验研究
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
衣霉素抑制细胞周期蛋白D1表达而强化TRAIL诱发凋亡的
实验研究
解继胜;张海燕;都镇先;邓娓娓;王华芹
【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAlL)联合衣霉素促甲状腺未分化癌细胞株凋亡的作用机制.方法通过单用TRAIL(TRAIL组)、衣霉素(衣霉素组)、联合用药组(TRAIL+衣霉素组)对多种甲状腺未分化癌细胞株进行作用,并以正常甲
状腺上皮细胞株HTori-3作对照,利用流式细胞仪分析各组细胞周期变化及各组细
胞凋亡状态;采用蛋白印迹杂交法检测衣霉素处理前后各组细胞细胞周期蛋白D1
蛋白表达水平;利用微小RNA干扰技术及质粒转染技术探讨细胞周期蛋白D1对依霉素增敏TRAIL效应的影响.结果 TRAIL与衣霉素单用对甲状腺癌细胞均无明显杀伤作用,最高细胞凋亡率分别为10.68%、10.14%;联合用药组细胞凋亡率最大达54.77%,与TRAIL组和衣霉素组相比,具有统计学差异(P<0.05).与对照组相比,衣霉素组和联合用药组细胞周期蛋白D1水平明显降低.微小RNA干扰可以特异性下调细胞周期蛋白D1进而增加ARO细胞对TRAIL的敏感性;而细胞周期蛋白D1过表达ARO细胞中细胞凋亡率降低22.7%.结论在体外单用TRAIL对甲状腺癌细胞增殖无明显抑制作用,衣霉素明显增加肿瘤细胞对TRAIL敏感性,其增敏机制至少部分与下调细胞周期蛋白D1水平有关.
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2010(039)007
【总页数】4页(P521-524)
【关键词】肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体;衣霉素;甲状腺肿瘤;细胞周期蛋白D1
【作者】解继胜;张海燕;都镇先;邓娓娓;王华芹
【作者单位】右江民族医学院,组织胚胎学教研室,广西,百色,533000;中国医科大学,附属第一医院老年病干诊科;中国医科大学,附属第一医院内分泌科,沈阳,110001;中国医科大学,附属第一医院老年病干诊科;中国医科大学,基础医学院生化与分子生物学教研室,沈阳,110001
【正文语种】中文
【中图分类】R736.1
近来研究显示[1]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)能诱导许多肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞基本没有影响,因而可能成为很有前景的抗癌药。但甲状腺恶性肿瘤细胞对TRAIL的敏感性具有相当的异质性[2,3]。因此,TRAIL 凋亡诱导增敏剂的发现将能有效扩展TRAIL的肿瘤治疗效应。衣霉素是一种天然抗生素,阻止细胞内N端连接寡糖类生物合成的第一步,曾用于TRAIL自发性耐药前列腺癌和获得性耐药大肠癌治疗[4],但其增加TRAIL抗肿瘤作用分子机制尚未阐明。为此,本研究以人甲状腺未分化癌细胞为对象,通过TRAIL单用及联用衣霉素,探讨衣霉素对TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的增敏效应及其机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株和主要试剂
甲状腺未分化癌ARO细胞株和正常甲状腺上皮细胞株HTori-3分别由美国标准生物品收藏中心和欧洲标准生物品收藏中心提供。衣霉素和可溶性TRAIL分别购于Sigma公司和R&D公司。以下抗体用于蛋白印记分析:γ-tubulin(Sigma公
司),phospho S249 Rb(Abcam 公司),cyclin D1(Santa Cruz生物工程公司)。ECL试剂盒(英国Amersham生命科学公司);脂质体2000转染试剂(Invitrogen公司)。
1.2 细胞培养及分组
2种细胞均于含10%胎牛血清1640(sigma公司)培养基中、37℃、5%CO2、饱和湿度下培养,2~3 d传代1次,均选用对数生长期细胞进行实验。按干预因
素将甲状腺未分化癌细胞ARO分为TRAIL组、衣霉素组、TRAIL+衣霉素组(联
合用药组);同时以正常甲状腺上皮细胞株HTori-3为对照(对照组)。单药组
为向细胞中分别加入 0,0.25,0.5,1.0,1.5,2.0 μg/ml TRAIL 和 0,1,2.5,5,10,20 μg/mL 衣霉素作用24或48 h;联合用药组为用5 μg/mL衣霉素预
处理24 h 后,应用0,0.25,0.5,1.0,1.5,2.0 μg/ml TRAIL处理细胞24 h。
1.3 细胞凋亡检测
按照厂商说明利用膜联蛋白-PE凋亡检试剂盒I(BD Bioscience)检测细胞死亡,然后经荧光活性细胞扫描(FACScan)流式细胞仪分析(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。每次试验至少计数500 个细胞核,所有试验均进行3次。
1.4 流式细胞计数法
细胞经70%乙醇固定,PBS再水化,碘化丙锭(Sigma)染色,然后利用流式细
胞计数法(FACScan,Becton Dickinson)分析DNA容量。细胞周期分布通过ModFit软件(Verity Software House)分析。流式细胞仪对各组细胞DNA含
量进行分析,2N峰代表G0/G1期,交叉峰代表S期,4N峰代表G2/M期。
1.5 Western blot检测多种蛋白表达
收集各组细胞,裂解破碎离心后,测上清蛋白浓度,用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和电转移法转至硝酸纤维素(PVDF)膜上,以5%脱脂奶粉TBST封闭后,
依次加入一抗phospho S249 Rb,cyclin D1;以γ-tubulin为内对照,4℃孵育
过夜,辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h,然后参照ECL试剂盒说明进行化学发光显像。
1.6 微小RNA干扰(siRNA)
本实验应用的微小干扰RNA序列如下:抗细胞周期蛋白D1 的 siRNA
(sicycD1),GUUCAUUUCCAAUCCGCCC;乱序的无意义siRNA(scramble,与任何已知基因无同源性,作为对照),CCGUAUCGUAAGCAGUACU;抗细胞周期蛋白D1的位点错配(下划线序列)siRNA(simutcycD1,用于确认
sicycD1的特异性),GUUCAUUUGGAAUCCGCCC。按照试剂盒说明利用阳离
子脂质体2000转染试剂将siRNA转染至细胞中。
1.7 构建细胞周期蛋白D1稳定过表达ARO细胞系
编码细胞周期蛋白D1的互补DNA(complementary DNA,cDNA)是利用PCR方法源于人脑cDNA 文库(Invitrogen,Carlsbad,CA),然后亚克隆至真核表达质粒pcDNA3。该构建物经DNA测序核实无误,按照试剂盒说明利用阳
离子脂质体2000转染试剂转染至细胞中。对照细胞用pcDNA3-Flag转染。转染细胞用G418(800 mg/mL)培养基进行筛选培养,得到阳性克隆后,进一步扩
增培养,利用细胞周期蛋白D1或Flag抗体通过免疫印迹分析鉴定相关阳性蛋白
表达细胞。
2 结果
2.1 衣霉素作用ARO对TRAIL的敏感性的影响
结果发现即使大剂量TRAIL(2 mg/ml)作用48 h,ARO细胞凋亡率仅为12%(图1A),表明ARO细胞抵抗TRAIL的抗肿瘤作用。20 mg/ml的衣霉素单独
用药,ARO细胞凋亡率为11.5%(图1B)。然而,5 mg/ml衣霉素预处理24 h 后,明显增加TRAIL诱导的ARO细胞凋亡,浓度为2 mg/ml时,ARO细胞凋亡率可高达56.5%,与TRAIL组、衣霉素组相比具有统计学差异(P<0.01)(图