狂犬病病毒分子流行病学研究进展

狂犬病病毒分子流行病学研究进展
摘要：狂犬病病毒分子流行病学研究是防控狂犬病暴发的前提。

已有的研究成果显示，对狂犬病病毒分子流行病学研究以全基因组测序为好，提高犬狂犬病疫苗免疫覆盖率和建立健全狂犬病疫情预警网络平台可能是扭转我国目前狂犬病高发的关键所在。

关键词：狂犬病；分子流行病学；研究进展
狂犬病为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病，临床典型特征为恐水，又名恐水症。

狂犬病是一种古老的疾病。

最早引用“狂犬病”术语是在4000多年前的巴比伦。

在没有疫苗问世之前的文献，人们谈病色变，因为一旦被狂犬咬伤必死无疑，以致不少被狗咬伤的人自杀。

1885年，路易斯·巴斯德首次发明了狂犬病疫苗，自此，被狂犬咬伤者的生存史发生了明显的改变[1]。

然而126年过去了，尽管现在已拥有3种有效的疫苗，但据WHO最新公布，全球每年死于狂犬病的患者仍有约30000—70000人，99％的死亡人数发生在热带发展中国家，如非洲、亚洲和南美洲。

美国近20年来，每年死于狂犬病的患者1—3例，而接受暴露后治疗的有25000—40000人，每人注射全程的狂犬病免疫球蛋白和接种5剂疫苗需花费约1000美元[2]。

而欧洲由于实行针对狐狸的口服免疫策略，近10年来，动物狂犬病已明显下降，其流行病学也发生了改变，西欧国家采取了对犬进行免疫，同时对犬进行严格管理，已基本上控制或消灭了人、畜狂犬病[3]。

当前我国狂犬病形势异常严峻，发病数已居世界第2位，仅次于印度[4]。

狂犬病在我国曾一度得到有效控制，值得关注的是我国城乡养犬、猫等宠物的家庭迅速增加，野犬、猫的数量均呈现增多的趋势，近10年来狂犬病疫情又有抬头和迅速回升的趋势[5]。

一旦发病，成功救治者罕见，死亡率几乎100％。

狂犬病的防控以免疫预防和疫情监测为主，分子流行病学监测正是防控狂犬病暴发的前提，研究包括基因型的鉴别、地域分布特征、遗传进化关系、生物学特性和快速溯源等，在采取积极的疾病预防策略方面有着重要的地位。

1 狂犬病病毒分子生物学特征
狂犬病病毒(RV)属于弹状病毒科狂犬病病毒属，为单股负链RNA病毒，由50个核苷前导序列以及分别编码核蛋白(N蛋白)、磷酸化蛋白(P蛋白)、基质蛋白(M蛋白)、糖蛋白(G 蛋白)和RNA依赖的RNA转录酶蛋白(L蛋白)的5种基因组成[6]。

RV颗粒外型呈子弹状，直径75nm，长100—300nm，由位于内部的螺旋状紧密核蛋白衣壳和带有穗状突起的囊膜构成。

1.1核蛋白(N蛋白)
N基因全长1421bp，开放阅读框(ORF)全长1353bp，编码450个氨基酸。

N蛋白是病毒中最稳定的蛋白，且能高效表达。

在RV复制过程中，NP与基因组RNA紧密结合成核糖核蛋白(RNP)，保护核酸免遭核酸酶的破坏。

此外，NP还在病RNA 从转录向复制切换方面起重要作用，并对病毒的转录与复制进行调解[7]。

另外，NP还是狂犬病病毒主要保护性抗原之一，能刺激机体产生细胞免疫。

1.2 磷酸化蛋白(P蛋白)
P基因全长991bp，ORF全长894bp，位于全基因1514—2407位核苷酸，编码297个氨基酸。

P蛋白为亲水性多肽，约占病毒总蛋白的6％。

P蛋白含有大量可结合磷酸基团的丝氨酸和苏氨酸磷酸化残基，因此，磷酸化是其结构的—个重要特点。

P蛋白与L蛋白相互作
用构成完整的转录酶活性，在病毒转录和复制中起主要作用[8]。

另外，P蛋白与N蛋白和L 蛋白一起组成核衣壳，具有病毒RNA转录和复制的全部活性P蛋白能够结合可溶性的N 蛋白形成N—P蛋白复合物以抑制其自身发生聚合，使其保持—种适合衣壳化的存在形式，并在N蛋白与P蛋白复合体中指导N P特异性的结合病毒RNA。

1.3 基质蛋白(M蛋白)
M蛋白是RV结构蛋白中最小的蛋白质，肽链含202个氨基酸残基，是一种连接蛋白，将核衣壳与病毒包膜连接在一起，对病毒的转录有负凋控作用，对复制有正调控作用，它在形成核衣壳前抑制转录而促进复制，在病毒的装配和出芽过程中都起到关键的作用[9]。

1.4 糖蛋白(G蛋白)
编码糖蛋白的G基因由1675个核苷酸组成，依据功能不同，分为4个区：l—57位核苷酸为信号肽编码区，58—1374位核苷酸为膜外区编码区，1375—1440位核苷酸为跨膜区编码区，1441—1575位核苷酸为膜内区编码区。

G基因只有一个开放读码框(ORF)，编码524个氨基酸糖蛋白前体。

糖蛋白前体切除N端的19个氨基酸残基后，在内质网中经糖基化等修饰成为成熟的糖蛋白。

成熟的糖蛋白共含505个氨基酸，分为3个区[10]：①膜外区：由1—439位氨基酸构成，参与识别受体与膜融合反应，并携带有B细胞和T细胞的抗原位点；②跨膜区：由440—461位的22个疏水氨基酸构成，协助G蛋白插入胞膜中；③膜内区：462—505位氨基酸，其羧基末端位于病毒包膜内表面，与M蛋白相接，有亲神经细胞的作用位点。

1.5 RNA依赖的RNA转录酶蛋白(L蛋白)
L基因全长6475bp，ORF全长6429bp，位于全基因5418—11846位核苷酸，编码2142个氨基酸L蛋白是RV最大的结构蛋白，约占病毒总蛋白的5％。

L 蛋白是一个多功能蛋白，负责病毒基因组的复制、转录及转录后加工，包括转录起始、延伸、终止甲基化、加帽和添加Poly(A) (多聚腺苷酸)尾[8]。

L蛋白被认为在不分节段负链RNA病毒的转录和复制过程中具有RN聚合酶活性，但是由于L蛋白在病毒颗粒和感染细胞中的含量很少，所以它是在生物化学和免疫学水平研究最少的一个蛋白。

2 狂犬病病毒分子流行病学现状
2.1 基于基因序列分析的分子流行病学研究
根据N蛋白基因的N末端500个核苷酸的相似率，RV分为6个基因型。

1998年Skerratt 等把在澳大利亚蝙蝠(果蝠)体内发现的新RV毒株，定为基因Ⅶ型[11]。

至此，RV共分为7个基因型。

近年来，狂犬病高发地区贵州、广西和湖南的狂犬病发病人数呈增长趋势。

为了分析其原因，Tao等[12]对2005—2007年问在3省区收集的2887份外表健康食用犬、4份可疑狂犬病病犬和3例狂犬病死亡患者的脑组织样本，先用抗RV的N蛋白直接免疫荧光法进行初筛，检出阳性样本73份，再用RT-PER法对其中60份阳性样本N基因下游的720bp片段进行扩增和测序。

系统进化分析树显示这些毒株都属于基因I型，可分成3个组，其中I组和Ⅱ组RV在家养犬中长期并普遍存在，呈地域性流行，是中国南方3省区主要的流行毒株。

Ⅲ组在谱系上更接近于犬狂犬病疫苗株和世界其他地区野生动物携带的RV。

3省区RV的传播具有高度的地域关联性，跨省传播往往与人携带病犬移动有关。

分离自人的RV株与同地区家养犬所带毒株亲缘性很近，证明家养犬是当地主要的储藏宿主。

表面健康犬的带毒阳性率在2.3％，提示狂犬病防控的重点还是应该放在家养犬的防疫和管理上。

为了摸清狂犬病流行中RV的分子流行病学特征，Zhang等[13]对2003—2008年间狂犬病流行区中7个省分离到的37株RV毒株进行了分子流行病学研究，通过与国内外已知的其他RV序列相比较，认为可将中国境内流行的RV I型分为I和Ⅱ两个进化分支。

分支I可
分为A—F,6个谱系，分支Ⅱ可分为G—L,6个谱系。

分支I包括大部分中国毒株和印尼、马来西亚、菲律宾、泰国、越南毒株，这与地域毗邻、经贸交流活跃密切相关；分支Ⅱ在中国只是偶然发现，而在世界其他地区的陆地动物中广泛存在。

同时研究者认为应该把在美洲蝙蝠和浣熊中流行的RV I型定为第3个分支，即分支Ⅲ。

我国在近10年间(1997—2008年)分离到的毒株主要属于分支I中的A谱系。

可以判定，A谱系RV是中国境内流行的优势毒株，并且是近期引起中国狂犬病第三次大流行的主要毒株。

其G蛋白共有5个位点的氨基酸发生替代aa90(T—M)、aa249(T—I)、aa289(S—T)、aa443(L—I)和aa486(Q—H)，这些替代只在A谱系中出现，通过这5个位点的确认，可以把A谱系毒株与分支I中的其他谱系毒株相区别。

RV及其相关病毒的全基因组序列比较研究首先由Delmas等[14]在2008年提出。

他将分属7个基因型的24株RV进行了全基因序列的遗传分析，发现所有的RV都有相同的基因组结构，与其他的RNA病毒相比，倾向于富含G+C。

各蛋白氨基酸的相似率由高到低分别是N>L>M>G>P；系统发育分析揭示各基因型病毒具有很强的地理分布特点，在非洲存在的RV基因型比其他地区都多；感染欧洲蝙蝠的两个基因型来自于同一个独立的起源；目前流行的基因II型病毒中，不同分离株的基因特征是不同的。

因此，该研究者认为应建立新的分子分型标准：进行全序列的遗传分析且序列的一致性定在76.4％—81.6％。

这种新的分型标准，比目前的部分基因分型标准更科学、严谨，得到的结果更可靠，是一种功能更强大的RV分型方法。

使用该方法，研究者将原先划分在基因II型中的0406SEN株定型为新的基因Ⅶ型。

全基因序列分型法有其先进性和科学性，如能进一步加以印证和完善，必然对RV 的分型和分子流行病学研究作出重大贡献。

2.2 基于氨基酸序列分析的分子流行病学研究
氨基酸序列的改变往往导致病毒生物学特性的变化，同时也是病毒适应环境(自然环境和生物环境)最直接的证据，通过建立氨基酸序列与环境的对应关系，就能方便地对RV进行溯源调查。

Ming等[15]对分离自湖南一发病死亡者脑组织的RV HNl0进行了全长基因的序列分析，发现全部5个编码蛋白序列中共有68个氨基酸发生了替代，分别与毒力、抗原性或病毒的增殖有关。

亲缘关系上与广西和湖南流行株较近，但与疫苗株CTNl81在序列上一致性最高，因此研究者认为疫苗CTNl81是最适合用于当地的狂犬病疫苗。

Camieli等[16]对从巴西的蝙蝠、犬科动物和家畜(牛和马)中分离到的RV进行了基因和氨基酸的序列分析。

通过对犬科动物和蝙蝠分离的RV的N基因及其氨基酸序列分析比较，将它们分为犬科动物RV组和蝙蝠RV组，其中犬科RV又可分为家养犬RV亚组和野生狐RV亚组，蝙蝠RV组可分为食虫蝙蝠RV亚组和吸血蝙蝠RV亚组，而对家畜(牛和马)分离RV的G 基因及其氨基酸序列分析比较，发现家畜分离的RV属于吸血蝙蝠RV亚组。

该研究表明，RV与宿主间可能存在一定的相关性。

RV基因I型中的G蛋白333位点(Arg／Lys)是公认的神经毒性关键位点，这个位点氨基酸的替换常常导致毒力减弱或消失。

目前为止，此位置的替换只在疫苗毒样中被发现。

但是，Sato等从巴西的蝙蝠中分离到3株RV，它们在333位点分别发生aa333(R／K—H)、aa333(R／K—N)和aa333(R／K—Q三种替换，可是在对成年鼠脑内途径感染后，却表现出致病性和致死性，说明毒株毒力很强，这一现象值得学者进行更深人的研究[17]。

三、前景
狂犬病是一种自然疫源性疾病，具有显著的地理分布特征。

随着人员、贸易和动物频繁交流，这种地域特征在某些地区正逐渐被打破，呈现流行的多型性。

在我国，狂犬病防控中主要存在的问题是：资金缺乏使得我国对家养犬的免疫覆盖率远低于国际标准的70％(WHO
认为接种率70％或更高可以有效阻断狂犬病在犬只中的传播，是防控犬狂犬病最有效的措施)。

但是，在我国由于免疫成本较高，管理措施不到位，导致犬只免疫覆盖率偏低，这是我国狂犬病发病率居高不下的最主要原因。

其次，缺乏有效的狂犬病疫情监测体系。

公共卫生监督系统与兽医监督系统之间缺乏有效的交流与合作，对狂犬病疫情资料不能及时共享。

因此。

通过对RV的基因测序特别是全基因组的测序，推导氨基酸序列，比较分析，绘制系统发育树，对确定RV分子特征、基因型、地理分布特征、宿主特征和流行病学监测都是必不可少的。

同时，应加快相关数据的收集和整理工作．尽快推出RV分子细化分型的新标准。

再以此为基础，建立狂犬病检测通报网络系统。

在第一时间了解本地及周边地区狂犬病流行信息，为狂犬病可能的暴发作出预测。

对于新发病例，利用狂犬病检测通报网络系统，可以做到快速溯源，为控制狂犬病的进一步流行提供可靠依据。

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