抑制剂筛选—酶学水平筛选
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六、试验报告内容及格式要求
（二）研究背景及意义 根据选择的题目，说明研究意义（为什
么进行上述的立项研究，为什么要设计以上试验， 目的及意义何在（老药新用、从天然产物中获得新的有 效治疗药物）不同筛选方法的应用范围等）。
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六、试验报告内容及格式要求
（三）试验方法 根据选择的题目，描述试验方法。 （四）试验结果 根据选择的题目，处理数据，并以图或表 的形式描述结果。 （五）讨论 分析结果，引用相关文献，并进行充分讨 论。
(0μ g/ml)
30s
60s
90s
120s
△OD
石杉碱甲
(0.01mg/ml)
加兰他敏
(0.01mg/ml)
A-小檗碱或 B-黄连生物
总碱(5μ g/ml)
A-小檗碱或 B-黄连生物 总碱(10μ g/ml) A-小檗碱或 B-黄连生物
总碱(20μ g/ml)
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（五）结果处理
1．线性范围结果及分析 （1）在测定酶活力的试验中，线性范围是非常重 要的因素，只有在线性范围内才可以将一定时间 范围内酶解的产物作为衡量酶活力大小的指标； （2）在试验方法学的建立上，首要确定在有或没 有各个抑制剂的情况下，酶解产物量都随时间呈 线性关系。方法是将表中OD405nm对时间作点线图， 做线性拟合，并记录相关系数R的值。
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1．薄层分析相关试剂配制
• 流动相：氯仿、甲醇、氨水体积比12:7:1。 • 缓冲溶液A：pH8.0的Tris-HCl（50mM）。 • 底物ATCI（2mmol/L）和显色剂DTNB （2mmol/L）混合液 。 • 酶液的制备：AChE酶用BufferB稀释至 3U/ml。
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（四）试验结果的原始记录
1．薄层筛选结果——数码相机纪录图片。参
考结果：黄连醇提取物，在此试验系统中，显示2个生物 碱斑点，在酶显色中，显示一个有白斑，另一斑点未显白 斑。
表2 对AChE抑制作用测定的原始数据记录表 OD值 0 溶剂空白对照
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三，测定方法原理
1．薄层法：用吸附，解吸附的方法把样品中 的活性成分分离开来。在薄层上喷底物、 Ach分解产物显色剂 酶 生物碱显色剂 检验。 2．紫外法：Ach分解产物显色剂，在有效成分 的酶抑制情况下，不显色，吸光度较小。通 过对吸光度的检测来监测有效成分的抑制作 用高低
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AchE抑制剂筛选—酶学水平筛选
武汉大学药学院 药理实验PPT 指导老师：丁虹 主讲人：丁虹
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一，实验背景（1）
• 酶学水平的药物筛选因为其方便、快速和 准确性，在现代药物筛选上占据越来越重 要的地位。 • 学会酶学水平的药物筛选，对于药学专业 的学生尤其重要。
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具体的显色原理
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四，教学试验安排及内容
（一）教学分组 （二）试验方案 （三）学生试验报告结果处理
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（一）教学分组
• 在一个教学单元内，根据学生人数，将学 生分为8组，每组2～5人，并分成上下两班， 4组/班。
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（二）试验方案
1．上半班采用化合物单体A（建议单体化合物为小 檗碱，也可采用各教学单位自行提取的生物碱）阳性对 照物用石杉碱甲、加兰他敏。 2．下半班采用含上述化合物单体的混合物B
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五、试验方法及步骤
（一）试验药品及配置 （二）试验器材 （三）试验步骤
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（一）试验药品及配置
• 试剂：CMC-Na、蒸馏水、硅胶G、无水乙 醇、甲醇、氯仿、Tris-盐酸、5%盐酸、氨 水、氢氧化钠、缓冲液B、AChE、碘化铋 钾； • 试验药品：小檗碱（or总碱）制成50μg/ml 储备液，试验时稀释成20μg/ml、10μg/ml、 5μg/ml工作液 。 • 阳性对照：加兰他敏（50µg/ml）、石杉碱 甲（50µg/ml）
（建议混合物为黄连生物总碱，也可采用各教学单位自行 提取的生物总碱）阳性对照物同上。
3．上下半班均采用薄层法、紫外法，对受试 物3个浓度进行分析测定。
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（三）试验报告结果处理
• 上下班分别统计各组数据进行分析处理。 • 比较上下半班数据特征，分析两种筛选方 法的特点。 • 如果试验中浓度与效应呈倒U型现象，请分 析之。
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（五）结果处理
2．根据紫外法测定的OD值，计算反应2min 的△OD值，根据△OD值，按下列公式计 算酶抑制率。 OD OD 抑制率%＝ OD ×100%
空白 样品 空白
OD＝OD2min后－OD2min前
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（五）结果处理
表3 受试物与石山碱甲、加兰他敏对AchE的抑制作用（χ±SD,n=4）
2.紫外分析相关试剂配制（全班8组共用）
• • • • • 缓冲溶液A：pH8.0的Tris-HCl（50mM） 缓冲溶液B：150mL含BSA0.1%的溶液。 缓冲溶液C ATCI底物溶液 DTNB溶液
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2.紫外分析相关试剂配制（全班8组共用）
• 阳性对照： ①加兰他敏，用DMSO稀释成0.01mg/ml的溶 液； ②石杉碱甲，用DMSO稀释成0.01mg/ml的溶 液。 • 样品制备： ①小檗碱（20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml）。 ②醇提取总碱 （20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml）。 • 酶样制备：将纯酶用缓冲溶液B配制成浓度3IU/ml 10ml，临用时配制。
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碱提取
BufferB DTNB ACTI AChE BufferB 总体积
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六、试验报告内容及格式要求
（六）注意事项
1．注意点样量不能太少，但也不能过多防止提取物浪费， 点样要均匀。 2．底物，显色剂溶液宜在展开的过程中配制，并注意避光 保存。为防止底物和显色剂变质，加入量可稍微大些。 3．三角喷瓶喷完底物后要充分洗干净后再装酶，注意保护 酶的活性及回收。 4．喷完前一种试剂，薄层要晾干后，再喷第二种液体。 5．酶在低温下活性不高，喷时注意其温度不可太低。
加入顺序和用量
加入顺序 空白调零 （μ l）
表1
注：阳性对照加兰他敏加入量与石杉碱甲一致。
小檗碱
石杉碱 甲 小檗碱 调零管 醇提取 总碱 调零 管
空白对 照
石杉碱甲 调零 管
醇提取
总碱
甲醇
石杉碱甲 小檗碱 醇提取
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（二）试验器材
• 样品配制：25ml烧杯，250ml烧杯，1000ml 烧杯。 • 薄层色谱：硅胶板（10cm×20cm）一块、 研钵、展开槽一只、三角喷瓶、普通点样用 毛细管、烘箱等。
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（二）试验器材：紫外测定
• 移液器（200、1000μl）EP（1、10ml）、量筒 （10ml）。 • 储液瓶、玻璃棒、50ml、100ml容量瓶、棕色储 液缸（容量约100ml）、10mL、1.5mLEP管若干。 • 微量石英比色皿。 • 紫外分光光度计、恒温水浴锅、洗瓶、擦镜纸若 干、500ml量筒、pH试纸、玻璃棒、废液缸、分 析天平、称量纸若干、药匙。 • 公用仪器设备：紫外分光光度计4～8台。
一，实验背景（2）
• AD的治疗尚无特效药物，其中乙酰胆碱酯 酶抑制剂（Acetylcholinesterase inhibitor， AchEI）一直是开发活跃、成果突出的领域。 • 已被FDA认可并在多国上市的加兰他敏等 均属AchEI类。
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二，实验目的
• 1．掌握酶抑制剂筛选的基本原理，了解酶 抑制剂筛选在新药研究中的作用与意义。 • 2．学习AchE抑制剂筛选方法，了解早老痴 呆及其治疗药物研究进展。 • 3．比较薄层筛选法与紫外筛选法的特点。 • 4．通过对待测化合物或混合物与目前常用 的AchE抑制剂—石杉碱甲、加兰他敏抑制 作用的比较，了解药物研发过程及结果判 断要点。
• 三角喷瓶
• 球形喷气导管
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2.紫外法观察受试样品对AChE抑制作用
（1）在1.5ml EP管中依次加：
样品→BufferB→DNTB→ACTI→（混匀） →AChE酶（具体加入试剂顺序和用量见如表1）。
（2）混匀，30s后倒入比色皿中开始测。
（3）所有试剂除酶外（防止酶在较高温度下变 质）都放于37℃恒温水浴锅中恒温。 （4）调零管加相同量Buffer B代替酶
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（三）试验步骤
1．薄层法观察受试样品对AChE抑制作用 2．紫外法观察受试样品对AChE抑制作用
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1.薄层法观察受试样品对AChE抑制作用
（1）点样 （2）展开 （3）酶显色 （4）酶显色结果评价 （5）生物碱显色
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点样，展开
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显色（喷板）
溶剂空白对照(0μ g/ml) 石杉碱甲(0.01mg/ml) 加兰他敏(0.01mg/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(5μ g/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(10μ g/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(20μ g/ml)
△OD
抑制率%
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六、试验报告内容及格式要求 （一）题目 根据你的理解或兴趣，可将报告题目拟定为： 1．“小檗碱、黄连生物总碱对AChE抑制作 用特征研究” 2．“薄层法、紫外法在筛选AChE抑制剂中 的特点比较” 3．自定。
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六、试验报告内容及格式要求
（二）研究背景及意义 根据选择的题目，说明研究意义（为什
么进行上述的立项研究，为什么要设计以上试验， 目的及意义何在（老药新用、从天然产物中获得新的有 效治疗药物）不同筛选方法的应用范围等）。
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六、试验报告内容及格式要求
（三）试验方法 根据选择的题目，描述试验方法。 （四）试验结果 根据选择的题目，处理数据，并以图或表 的形式描述结果。 （五）讨论 分析结果，引用相关文献，并进行充分讨 论。
(0μ g/ml)
30s
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△OD
石杉碱甲
(0.01mg/ml)
加兰他敏
(0.01mg/ml)
A-小檗碱或 B-黄连生物
总碱(5μ g/ml)
A-小檗碱或 B-黄连生物 总碱(10μ g/ml) A-小檗碱或 B-黄连生物
总碱(20μ g/ml)
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（五）结果处理
1．线性范围结果及分析 （1）在测定酶活力的试验中，线性范围是非常重 要的因素，只有在线性范围内才可以将一定时间 范围内酶解的产物作为衡量酶活力大小的指标； （2）在试验方法学的建立上，首要确定在有或没 有各个抑制剂的情况下，酶解产物量都随时间呈 线性关系。方法是将表中OD405nm对时间作点线图， 做线性拟合，并记录相关系数R的值。
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1．薄层分析相关试剂配制
• 流动相：氯仿、甲醇、氨水体积比12:7:1。 • 缓冲溶液A：pH8.0的Tris-HCl（50mM）。 • 底物ATCI（2mmol/L）和显色剂DTNB （2mmol/L）混合液 。 • 酶液的制备：AChE酶用BufferB稀释至 3U/ml。
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（四）试验结果的原始记录
1．薄层筛选结果——数码相机纪录图片。参
考结果：黄连醇提取物，在此试验系统中，显示2个生物 碱斑点，在酶显色中，显示一个有白斑，另一斑点未显白 斑。
表2 对AChE抑制作用测定的原始数据记录表 OD值 0 溶剂空白对照
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三，测定方法原理
1．薄层法：用吸附，解吸附的方法把样品中 的活性成分分离开来。在薄层上喷底物、 Ach分解产物显色剂 酶 生物碱显色剂 检验。 2．紫外法：Ach分解产物显色剂，在有效成分 的酶抑制情况下，不显色，吸光度较小。通 过对吸光度的检测来监测有效成分的抑制作 用高低
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AchE抑制剂筛选—酶学水平筛选
武汉大学药学院 药理实验PPT 指导老师：丁虹 主讲人：丁虹
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一，实验背景（1）
• 酶学水平的药物筛选因为其方便、快速和 准确性，在现代药物筛选上占据越来越重 要的地位。 • 学会酶学水平的药物筛选，对于药学专业 的学生尤其重要。
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具体的显色原理
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四，教学试验安排及内容
（一）教学分组 （二）试验方案 （三）学生试验报告结果处理
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（一）教学分组
• 在一个教学单元内，根据学生人数，将学 生分为8组，每组2～5人，并分成上下两班， 4组/班。
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（二）试验方案
1．上半班采用化合物单体A（建议单体化合物为小 檗碱，也可采用各教学单位自行提取的生物碱）阳性对 照物用石杉碱甲、加兰他敏。 2．下半班采用含上述化合物单体的混合物B
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五、试验方法及步骤
（一）试验药品及配置 （二）试验器材 （三）试验步骤
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（一）试验药品及配置
• 试剂：CMC-Na、蒸馏水、硅胶G、无水乙 醇、甲醇、氯仿、Tris-盐酸、5%盐酸、氨 水、氢氧化钠、缓冲液B、AChE、碘化铋 钾； • 试验药品：小檗碱（or总碱）制成50μg/ml 储备液，试验时稀释成20μg/ml、10μg/ml、 5μg/ml工作液 。 • 阳性对照：加兰他敏（50µg/ml）、石杉碱 甲（50µg/ml）
（建议混合物为黄连生物总碱，也可采用各教学单位自行 提取的生物总碱）阳性对照物同上。
3．上下半班均采用薄层法、紫外法，对受试 物3个浓度进行分析测定。
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（三）试验报告结果处理
• 上下班分别统计各组数据进行分析处理。 • 比较上下半班数据特征，分析两种筛选方 法的特点。 • 如果试验中浓度与效应呈倒U型现象，请分 析之。
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（五）结果处理
2．根据紫外法测定的OD值，计算反应2min 的△OD值，根据△OD值，按下列公式计 算酶抑制率。 OD OD 抑制率%＝ OD ×100%
空白 样品 空白
OD＝OD2min后－OD2min前
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（五）结果处理
表3 受试物与石山碱甲、加兰他敏对AchE的抑制作用（χ±SD,n=4）
2.紫外分析相关试剂配制（全班8组共用）
• • • • • 缓冲溶液A：pH8.0的Tris-HCl（50mM） 缓冲溶液B：150mL含BSA0.1%的溶液。 缓冲溶液C ATCI底物溶液 DTNB溶液
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2.紫外分析相关试剂配制（全班8组共用）
• 阳性对照： ①加兰他敏，用DMSO稀释成0.01mg/ml的溶 液； ②石杉碱甲，用DMSO稀释成0.01mg/ml的溶 液。 • 样品制备： ①小檗碱（20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml）。 ②醇提取总碱 （20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml）。 • 酶样制备：将纯酶用缓冲溶液B配制成浓度3IU/ml 10ml，临用时配制。
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六、试验报告内容及格式要求
（六）注意事项
1．注意点样量不能太少，但也不能过多防止提取物浪费， 点样要均匀。 2．底物，显色剂溶液宜在展开的过程中配制，并注意避光 保存。为防止底物和显色剂变质，加入量可稍微大些。 3．三角喷瓶喷完底物后要充分洗干净后再装酶，注意保护 酶的活性及回收。 4．喷完前一种试剂，薄层要晾干后，再喷第二种液体。 5．酶在低温下活性不高，喷时注意其温度不可太低。
加入顺序和用量
加入顺序 空白调零 （μ l）
表1
注：阳性对照加兰他敏加入量与石杉碱甲一致。
小檗碱
石杉碱 甲 小檗碱 调零管 醇提取 总碱 调零 管
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石杉碱甲 调零 管
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（二）试验器材
• 样品配制：25ml烧杯，250ml烧杯，1000ml 烧杯。 • 薄层色谱：硅胶板（10cm×20cm）一块、 研钵、展开槽一只、三角喷瓶、普通点样用 毛细管、烘箱等。
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（二）试验器材：紫外测定
• 移液器（200、1000μl）EP（1、10ml）、量筒 （10ml）。 • 储液瓶、玻璃棒、50ml、100ml容量瓶、棕色储 液缸（容量约100ml）、10mL、1.5mLEP管若干。 • 微量石英比色皿。 • 紫外分光光度计、恒温水浴锅、洗瓶、擦镜纸若 干、500ml量筒、pH试纸、玻璃棒、废液缸、分 析天平、称量纸若干、药匙。 • 公用仪器设备：紫外分光光度计4～8台。
一，实验背景（2）
• AD的治疗尚无特效药物，其中乙酰胆碱酯 酶抑制剂（Acetylcholinesterase inhibitor， AchEI）一直是开发活跃、成果突出的领域。 • 已被FDA认可并在多国上市的加兰他敏等 均属AchEI类。
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二，实验目的
• 1．掌握酶抑制剂筛选的基本原理，了解酶 抑制剂筛选在新药研究中的作用与意义。 • 2．学习AchE抑制剂筛选方法，了解早老痴 呆及其治疗药物研究进展。 • 3．比较薄层筛选法与紫外筛选法的特点。 • 4．通过对待测化合物或混合物与目前常用 的AchE抑制剂—石杉碱甲、加兰他敏抑制 作用的比较，了解药物研发过程及结果判 断要点。
• 三角喷瓶
• 球形喷气导管
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2.紫外法观察受试样品对AChE抑制作用
（1）在1.5ml EP管中依次加：
样品→BufferB→DNTB→ACTI→（混匀） →AChE酶（具体加入试剂顺序和用量见如表1）。
（2）混匀，30s后倒入比色皿中开始测。
（3）所有试剂除酶外（防止酶在较高温度下变 质）都放于37℃恒温水浴锅中恒温。 （4）调零管加相同量Buffer B代替酶
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（三）试验步骤
1．薄层法观察受试样品对AChE抑制作用 2．紫外法观察受试样品对AChE抑制作用
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1.薄层法观察受试样品对AChE抑制作用
（1）点样 （2）展开 （3）酶显色 （4）酶显色结果评价 （5）生物碱显色
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点样，展开
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显色（喷板）
溶剂空白对照(0μ g/ml) 石杉碱甲(0.01mg/ml) 加兰他敏(0.01mg/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(5μ g/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(10μ g/ml) A-小檗碱或B-黄连生物 总碱(20μ g/ml)
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抑制率%
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六、试验报告内容及格式要求 （一）题目 根据你的理解或兴趣，可将报告题目拟定为： 1．“小檗碱、黄连生物总碱对AChE抑制作 用特征研究” 2．“薄层法、紫外法在筛选AChE抑制剂中 的特点比较” 3．自定。