HIV化学发光免疫诊断试剂盒的研制_买制刚

ncu
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N1 010 206 < 011
RLU
ncu
P1 1011 715 1718 213
N2 010 114 < 011
P2 1817 565 2718 105
N3 010 249 < 011
P3 1013 525 1810 498
N4 010 167 < 011
P4 1917 952 2819 395
N5 010 194 < 011
P5 4119 797 5116 638
N6 010 387 011 710 P6 2716 264 3711 426
N7 010 202 < 011
P7 1017 187 1815 068
N8 010 355 011 412 P8 3118 316 4114 319
作者单位 :1 华美生物工程公司 (洛阳 471003) ;2 郑州大学化学 系 (郑州 450052) .
通讯 作 者 : 买 制 刚 , Tel : 07552266314202216 , E2mail : maizhigang @ hotmail . com
51 抗原包被板的制备 按 1∶1∶2 的比例把重组抗原 gp120 、gp41 和合成 肽 gp36 混合 ,然后以 5μgΠ孔的量加入到微孔板中 , 37 ℃包被 2 h ,封闭后晾干备用 。 61 酶标记抗原的制备 采用改良过碘酸钠法把混合抗原 (gp120 、gp41 和合成肽 gp36) 与碱性磷酸酶 (ALP) 偶联[4] 。 71 HIV Ⅰ+ Ⅱ型抗体双抗原夹心定量检测试 剂盒的制备 样品 加 到 上 述 已 制 备 好 的 固 相 有 重 组 抗 原 gp120 、gp41 和合成肽 gp36 的白色不透明的条板微 孔中 ,37 ℃反应 60 min ,用 Biotek 洗板机洗板 5 次 ,洗 掉未反应的成分 ,再加入抗原2碱性磷酸酶结合物 , 37 ℃反应 60 min ,此标记抗原与被固相抗原捕获的 HIV 抗体上的另一位点特异性结合 。洗掉游离成分 (用 Biotek 洗板机洗板 5 次) 。加入底物工作液 ,ALP 催化底物脱磷酸酯 ,并发出 463 nm 的可见光 。于室 温反应 10 min , 测定各加样品孔的相对发光单位 (RLU) 。样品的 RLU 与其中的 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体浓 度呈正相关 。样品中的 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体浓度依据 由校准品 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体浓度和对应的 RLU 建立 的数学模型进行定量 。
浓度范围
正常人标本
110 ncu 以上
1
015～110 ncu
0
012～015 ncu
11
< 0112 ncu
388
抗体阳性标本 92 92 92 92
表 3 ELISA 方法检测中检所 45 份 Pannel 的结果
样品
阴性 Pannel 原始 计算浓度 样品
阳性 Pannel 原始 计算浓度
RLU
N17 010 440 012 208 P17 415 100 1010 107
N18 010 148 < 011 P18 711 603 1318 564
N19 010 275 < 011 P19 016 607 217 532
N20 010 128 < 011 P20 714 776 1412 920
N13 010 235 < 011 P13 914 291 1618 760
N14 010 211 < 011 P14 2213 605 3116 738
N15 010 152 < 011 P15 1614 601 2512 715
N16 010 205 < 011 P16 1816 148 2716 543
中国生物制品学杂志 2005 年 11 月第 18 卷第 6 期 Chin J Biologicals November 2005 , Vo1. 18 No. 6
N9 115 054 314 285 P9 1519 423 2416 855
N10 011 149 017 596 P10 518 381 1119 893
N11 010 145 < 011 P11 34811 557 34915 763
N12 010 128 < 011 P12 42812 687 42713 999
45 份 HIV 抗体质控参比血清 ( Pannel 批号 200303 ,其 中阳性 20 份 ,即 P1～P20 ;阴性 20 份 ,即 N1～N20 ; 另有 S21～S25 五份稀释度) 。HIV 的 Pannel 是国家 控制 HIV ( Ⅰ + Ⅱ) 试 剂 盒 的 标 准 , 它 规 定 阳 性 Pannel 检出率应达到 100 % ,阴性 Pannel 检出率 > 90 % ,S21～S25 应至少检出后 3 份为阳性 ,为防止 Hook 效应 ,设置检测读数上 P12 > P11 。结果阳性检 出率为 100 % ,而且 S21～S25 系列稀释度比规定还 多检出 1 份阳性 ,阳性检出率为 95 % (只有 N9 为假 阳性) 。从计算浓度的量值看 , S22～S25 的倍比稀 释关系明显 ,S21 为稀释用阴性血清 ,见表 3 。
【关键词】 化学发光酶免疫分析法 ;人类免疫缺陷病毒 ;双抗原夹心法
本试剂盒采用 ELISA 双抗原夹心法 ,定量测定 人血清 (浆) 中 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体含量 ,灵敏度高 ,特 异性强 ,定量准确 ,方便快速 ,无环境污染 ,含全组 分 ,适用于对相应疾病诊断及疗效的评价 。
材料与方法
中国生物制品学杂志 2005 年 11 月第 18 卷第 6 期 Chin J Biologicals November 2005 , Vo1. 18 No. 6
HIV 化学发光免疫诊断试剂盒的研制
·511 · 【诊断制品】
买制刚1 杨青1 李振勇2 李建军2 屈凌波2
【 摘要 】 目的 研制敏感 、特异的人类免疫缺陷病毒 Ⅰ+ Ⅱ型 ( HIV Ⅰ+ Ⅱ) 化学发光免疫试剂盒 。方法 采用碱性磷 酶标记重组 gp120 、gp41 和合成肽 gp36 抗原 ,金刚烷胺增敏化学发光体系作为酶底物 ,采用 ELISA 双抗原夹心法检测 。结果 敏感度为 011 ncu ;检测范围为 011～100 ncu ; HIV 浓度为 015 、112 、511 、1918 ncu 时 ,批内变异系数 3 %～8 % ( n = 20) ,批间变异 系数 5 %～9 %( n = 20) ;与 anti2HAV、anti2HBV、anti2HCV、anti2HEV 无交叉反应 ;具有良好的稳定性 ,在 1 年的效期内 (4 ℃保存) 其整体变化幅度 < 10 %。结论 该试剂盒灵敏度高 ,特异性好 ,稳定性强 ,检测范围宽 ,有良好的准确性和重复性 。
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中国生物制品学杂志 2005 年 11 月第 18 卷第 6 期 Chin J Biologicals November 2005 , Vo1. 18 No. 6
11 试剂 根据已知的 HIV2 Ⅰ和 HIV2 Ⅱ的基因序列和抗 原决定簇位点 ,设计包被用重组抗原 gp120 、gp41 和 合成肽 gp36[1 ,2] 。HIV 抗体血清来源于中国药品生 物制品检定所 ;酶标记重组抗原 gp120 、gp41 和合成 肽 gp36 、碱性磷酸酶 (ALP) ,购自 Sigma ;增敏化学发 光底物 CSPDR○及增强剂 ,购自 BioRad Co. 。 21 校准品的配制 筛选出高滴度的 HIV Ⅰ + Ⅱ抗体阳性血清 。 经过系列稀释后 , 用中国卫生部临床检验中心的 HIV Ⅰ+ Ⅱ灵敏度 Pannel 进行标定 ,确定浓度分别 为 0 、012 、015 、510 、2010 和 100 ncu 。 31 增敏化学发光底物工作液的配制 将 600 μl diethanolamine 、100μl MgCl2 (1 molΠL) 和 100μl 10 % NaN3 加入 80 ml Tris2HCl (pH 910) 缓 冲液中混匀 ,定容至 100 ml ,高压蒸汽灭菌 ,即成底 物缓冲液 。取底物缓冲液 800μl ,加入 200 μl 增强 剂 ,50μl CSPDR○ ,于灭菌容器内混匀 ,即成底物工作 液[3] 。 41 缓冲液的配制 按常规方法配制 。
51 重复性 分别用平均含量为 015 、112 、511 和 1918 ncu 的 质控血清进行检测 , 批内变异系数分别为 716 %、 518 %、413 %和 318 %( n = 20) ,批间变异系数分别为 811 %、612 %、511 %和 513 % ( n = 20) 。多人次检测 后 ,4 份质控血清浓度范围分别为 014 ～ 017 ncu 、 110～114 ncu 、412～610 ncu 和 1719～2118 ncu 。 61 稳定性 将试剂盒放置在 37 ℃环境中加速破坏 6 d ,再 检测各项技术指标 ,最低检测限仍能达到 011 ncu , 特异性与上述结果差异无显著意义 ,重复检测的变 异系数均小于 10 % ,4 份质控血清检测浓度分别在 014～017 ncu 、110～114 ncu 、412～610 ncu 和 1719～ 2118 ncu 的范围内 。 71 与进口试剂的比较 用本试剂盒与 Abbott ELISA 试剂盒同时检测 102 份献血员和 90 份抗2HIV 阳性标本 ,两者结果符 合率均为 100 %。
表 1 灵敏度检测数据 灵敏度 Pannel 浓度 010 ncu 平均值 + 3SD 0105 ncu 011 ncu 015 ncu
1批 01035 01039 01051 01076
2批 01042 01043 01055 01079
3批 01034 01042 01048 01077
表 2 正常人参考值统计表
述 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体化学发光定量检测试剂盒检 测 ,结果阴性标本的浓度范围为 010～213 ncu ,阳性 标本为 118～ > 100 ncu ,结果见表 2 。
从上表可以看出 ,所有抗体阳性的标本检测浓度 都高于 1 ncu 。而正常人标本中仅有 1 份检测浓度高 于 1 ncu 。所以在本次实验中 015 ncu 和 110 ncu 作为 阈值时 ,其临床灵敏度和特异度是相同的 ,灵敏度 100 % ,特异度 99175 %。最终确定的阈值为 015 ncu 。
S21 010 211 < 011 S23 014 312 210 338
S22 011 520 019 676 S24 111 317 412 133
S25 315 777 815 444
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结 果
11 最低检测限 以 0 值 + 3 SD 为检测的最低检测限 ,用本试剂 盒检测经校准的 HIV 阳性血清 ,结果为最低检测限 011 ncu ,见表 1 。 21 正常人参考范围( 阈值) 的确定 收集 400 份正常人的血清 (浆) 样本 ,其中男 202 份 ,女 198 份 ,年龄 13～64 岁 。另外收集已经确诊 的 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 抗体阳性的血清标本 92 份 。用上
31 特异性 检测其它病毒性传染疾病抗体 (anti2HAV 、anti2 HBV 、anti2HCV 、anti2HEV) 呈阳性的血清合计 82 份 , 结果本 HIV ( Ⅰ+ Ⅱ) 试剂盒与 anti2HAV 、anti2HBV 、 anti2HCV 及 anti2HEV 无交叉反应 。 41 检测国家质控参比血清 用本试剂盒检测中国药品生物制品检定所的