人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定

人真皮成纤维细胞的分离培养及鉴定

作者：马英智张丽红孙梅李玉林

【摘要】目的对人真皮成纤维细胞(hFbs)进行分离培养及鉴定，为组织工程复合皮肤的构建提供种子细胞。方法利用组织块培养法、消化传代纯化培养hFbs，通过细胞形态的观察及免疫细胞化学、流式细胞术等方法对其进行鉴定。结果经组织块培养法获得的细胞可以传代培养，从P1代到P6代细胞形态保持一致，呈纤维细胞样生长;免疫细胞化学检测可见波形蛋白(vimentin)呈阳性反应，通过流式细胞术检测P3及P6代的细胞vimentin阳性表达量均达到95%以上，角蛋白15(cytokeratin 15)呈阴性表达。结论成功建立体外稳定培养hFbs 的方法，为组织工程皮肤的研究提供了理论与实验基础。

【关键词】成纤维细胞;分离;培养;鉴定

【Abstract】Objective To explore a method of the isolation, culture and identification of human fibroblasts (hFbs) in vitro for the provision of seed cells in tissue engineering skin. Methods The cells were cultured and expanded and observed under phase contrast microscope, and they were identified with immunocytochemistry and flow cytometry (anti vimentin, cytokeratin 15). Results With phase contrast microscope, the cells were observed to uniformed population of cells and fibroblast like. Immunocytochemistry and flow cytometry showed all cultural cells were fibroblasts (positive

for vimentin, negative for cytokeratin 15). The cells were sub cultured 6 generations. Conclusions A method for isolating and culturing hFbs in vitro is established successfully.

【Key words】Fibroblasts;Isolation;Culture;Identification

成纤维细胞是构成皮肤真皮的主要细胞，其正常的增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。本实验旨在探索一种简单、高效分离培养人真皮成纤维细胞(human fibroblasts，hFbs)的技术方法，为进一步利用组织工程学构建复层皮肤奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12(Gibco)，优等胎牛血清，Dispase Ⅱ(Roche)，胰蛋白酶(Sigma)，Triton X100(Sigma)，鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(Santa)，兔抗人角蛋白15单克隆抗体(Abcam)，免疫组化S P试剂盒(迈新)，DAB显色液(迈新)，FITC标记的抗鼠和抗兔IgG(北京中杉)。

1.2 hFbs的分离培养

1.2.1 原代培养取包皮环切术的正常皮肤组织，用含青链霉素的PBS冲洗3次，尽量去除皮下结缔组织;将皮肤剪成小块，真皮面朝下平铺于平皿中，加入DispaseⅡ4℃条件下过夜;次日分离表皮真皮，将真皮剪切成小块，接种于35 mm培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养1 h，加入少量含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)，次日加入足量培养基继续培养，以后每3 d换一次液。

1.2.2 传代用0.25%胰酶0.02%EDTA消化约1 min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入含10%优等胎牛血清的DMEM/F12(3∶1)终止消化，用吸管吹打细胞，以1∶3比例传代培养。

1.3 形态学观察利用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及形态变化。

1.4 免疫细胞化学取爬片的P6代细胞，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室温固定20 min;PBS清洗，0.1%Triton X100孵育10 min;3%的过氧化氢室温阻断20min;PBS清洗，血清覆盖20 min;稀释度为1∶100的鼠抗人波形蛋白(Vimentin)一抗和兔抗人角蛋白(Cytokeratin，CK)15一抗4℃过夜;PBS清洗，加入二抗室温孵育30 min;PBS清洗后加DAB，苏木素复染;同时用PBS代替一抗作阴性对照，显微镜下观察照相。

1.5 流式细胞术用0.25%胰酶0.02%EDTA消化收集P3和P6代细胞，使其细胞数为2×105个/每例样本;PBS清洗，0.1%Triton X100室温10 min;PBS清洗，用稀释度为1∶50的鼠抗人Vimentin 一抗和兔抗人CK 15一抗常温下孵育30 min;PBS清洗，加入稀释度为1∶50的FITC标记的抗鼠和抗兔的IgG为二抗，4℃避光孵育30 min;PBS清洗2次，加入400 μl PBS重悬细胞用于FACS分析。 2 结果

2.1 形态学观察利用倒置相差显微镜观察培养不同阶段的细胞形态，原代培养3 d后，可见有细胞从组织块周围爬出，细胞呈

纺锤状，如纤维细胞样生长。第7～10天时可见大量细胞生长，呈鱼群样。见图1。传代培养的hFbs生长旺盛，3～4 d达到汇流，形态与原代相似、更加趋向一致。细胞呈长梭形，核呈椭圆形，可见1～2个核仁。本实验中hFbs可传代培养至11代，其形态及生长特点无明显改变。

2.2 免疫细胞化学免疫细胞化学结果显示P6代hFbs中胞浆染成深棕色，见图2。Vimentin呈阳性，CK 15呈阴性表达。

图1 原代培养第10天(×4)图2 免疫化学染色(×20)

2.3 流式细胞术通过流式细胞术检测hFbs的标志，经3代以上传代后，细胞成分均一，Vimentin阳性细胞占总数的95%以上，具有较高的纯度;CK 15阳性细胞占总数的4%以下，为阴性表达。

3 讨论

组织工程是在20世纪80年代正式提出来的一个新概念，综合应用工程学和生命科学的基本原理、基本理论和基本技术将分离培养的高密度功能细胞接种在可降解的三维支架材料上，其中种子细胞的研究是组织工程众多研究领域中最基础、也是最重要的环节〔1〕。由于成纤维细胞具有较强的分裂、增殖能力，适应性强，易培养、性状稳定，而且还能分泌一些细胞因子和细胞外基质成份，可促进表皮细胞的增殖、移动与成熟，在调节表皮细胞形态及真皮重组方面起重要作用〔2〕。因此，成纤维细胞在构建组织工程皮肤中起着至关重要的作用。本实验的远期目标是构建组织工程复合皮肤，而建立一种简单、高效分离培养hFbs的技术方法是最基本的。采用组织块培养法进