生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景

生物技术在水产遗传育种中的研究进展与应用前景摘要：本文综述了生物技术在水产遗传育种中的应用与研究,包括人工雌核生

殖和雄核生殖, 多倍体诱导, 细胞核移植, 细胞和组织培养, 细胞融合和基因工程等。

关键词生物技术；遗传育种；水产动物；应用

1 引言

生物技术是指人们运用现代生物学、工程学和其它基础学科的知识, 按照预先的设计对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能, 用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。近十几年来, 生物技术迅猛发展, 方兴未艾。

本文就人工雌核生殖和雄核生殖、多倍体育种、细胞核移植、细胞和组织培养、细胞融合和基因工程在水产遗传育种方面的研究进展作一综述。

2 人工雌核生殖和雄核生殖

2.1 雌核生殖

雌核生殖是指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。自然界存在这种单性生殖的水生动物, 人工诱发手段也可使未受精卵进行雌核生殖, 但产生的个体绝大多数是单倍体, 难以存活, 需紧接着二倍化的特殊处理。诱发雌核发育除了可以加快建立选育系和控制性别外, 还可以使一些稀有的隐性等位基因显现而产生新的优良胜状, 使具有重要经济性状的显性基因转为纯合状态, 雌核发育后代还可用来鉴定鱼类的近交衰退现象等。常用诱发雌核生殖的方法有射线照射、化学药品处理、带血玻璃针激活以及杂交(异质精子穿入卵但精核不参于发育)等。二倍化的方法通常使用温差(冷或热休克) 、水静压、药品（如秋水仙素和细胞松驰素B (简称C S) ）处理等。

我国蒋一硅等[1]和吴清江等[2]曾分别成功地应用了y射线辐射鱼类精液后诱导红螂鱼卵和鲤鱼卵的雌核生殖。在对虾方面的研究, 蔡难儿[3]首先报道了采用与研究鱼类人工诱导雌核发育相类似的四步诱导法对中国对虾进行人工诱导雌核发育, 育出三批雌核发育的个体但要大规模生产仍存在一定的困难。

2.2 雄核生殖

雄核生殖是指卵子只依靠雄性原核进行发育的生殖方式。人工雄核生殖同人工雌核生殖一样, 也要经过诱发雄核生殖并使之二倍化的两个步骤。目前诱发方法有去除卵核、射线破坏卵核、杂交和用过熟或老化的卵子受精等。

刘汉勤等[4]用类似方法使泥鳅精子与大鳞副泥鳅卵子授精后挑去雌核从而获得泥鳅雄核生殖单倍体。叶玉珍等[5]也用了射线处理鲤、鲤鱼类成熟卵, 获得了二倍体雄核发育鱼苗。另外, 许多研究证明不同种类的杂交可以产生雄核生殖。水产生物的雄核单倍体难以存活, 须在发育早期二倍化。

3多倍体育种

三倍体生物由于节省了繁育后代所需的能量消耗, 故生长个体大, 因此海产动物三倍体育种是应用生物技术提高海产品产量的有效途径。我国最早开展虾类多倍体育种是在1989 年6 ~ 12 月, 相建海[6]以锐脊单肢虾( Sicyonia ingentis) 为材料在国际上首次获得对虾三倍体幼体。该成果备受国内外学者的关注。近年中国科学院海洋研究所在对虾三倍体和四倍体研究中又取得进展, 经过条件的优化, 中国对虾三倍体的最高诱导率可达90% 以上; 在胚胎期检验, 四倍体最高诱导率达90%以上。

大连水产学院王子臣早在1986 年就开始对鲍鱼三倍体进行研究。近期他们在前期工作的基础上, 使北方皱纹盘鲍和南方九孔鲍增加染色体数量形成三倍体, 使稚鲍的成活率提高一倍, 生长周期缩短了三分之一, 此项技术产业化后已累计生产三倍体鲍400 多万枚, 首次实现了鲍三倍体的规模化生产。

4 细胞核移植技术

这是一种将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术, 是50 年代初由美国学者Briggs 和King 首创的[7]。他们以豹蛙为材料, 将囊胚期的动物极细胞核移入另一去核的卵子中, 获得正常发育的胚胎, 引起了国际上的重视。而后这一技术广泛地应用于细胞分化、核质关系和发育机理等重大生物学问题的研究。1961 年童第周率先在金鱼和鱼旁鱼皮鱼中进行同种鱼的细胞核移植[8], 证明细胞核移植也可以在鱼类中进行。之后, 童第周等在这两种鱼间进行亚科之间的细胞核移植, 获得多种核质杂种鱼, 严绍颐等将鲤鱼胚细胞核移植到鲫鱼去核卵中, 获得的核质杂交鱼具有较高的养殖价值[ 9]。谢忠明等以鲤鲫移核鱼二代为父本, 黑龙江散鳞镜鲤为母本, 经常规有性杂交获得第1 代杂交种颖鲤, 已在20 个省、市、自治区推广养殖[10] 。细胞核移植已在水产生物的遗传育种中发挥重要作用, 但仅局限于鱼类和两栖类, 对于虾、蟹、贝、藻类还一无所知。另外, 并非所有核质杂交种都可以培育成新品种, 也不是所有的核质杂交种都有受体物种的性状, 如鲫鱼细胞核和鲤鱼细胞质配合的杂种鱼基本上相似于供体鱼( 鲫鱼) 的性状, 更不是所有的种间杂交屏障都可以借助细胞核移植技术来突破, 因此, 该技术应用于水产生物的育种还有大量工作需要完成。

5 细胞和组织培养

细胞和组织培养技术是把生物的细胞或组织分离、培养、诱导再生或快速繁殖的技术。目前, 这项技术已广泛应用于鱼类细胞、珍珠贝外套膜上皮细胞以及海藻组织和细胞等的培养。水产动物细胞培养起始于鱼类, 己有许多鱼类细胞株相继建成。这些细胞系具有多方血的用途, 可代替活体动物用于病毒研究, 可用于染色体制作等遗传学研究, 用于制作细胞疫苗, 作为细胞核移植育种研究中供体细胞核来源, 以及毒性和水质监测等的指示生物(细胞比鱼体对有毒物质史敏感)等。

鱼类细胞培养与细胞核移植结合使用, 在良种培养中起着重要作用。陈宏溪等[11]把鲫鱼胚胎的继代培养细胞核转移到鲫鱼的未受精去核卵中,培养出世界上第1 尾无性繁殖鱼。他们还用类似技术, 由短期培养的性成熟鲫鱼的肾细胞, 获得1尾发育到性成熟的体细胞工程鱼, 使鱼类细胞水平上的遗传育种成为可能。余来宁等[12]采用电融合结合继代移核法, 将对草鱼出血病病毒( FRV) 有抗性的草鱼肝细胞株(GLA) 的细胞核,移植到草鱼未受精卵内, 获得了一批不同

发育期的胚胎和存活的仔鱼。可见, 用细胞工程育种的方法, 培育抗病草鱼是大有前途的, 也为鱼类体细胞育种提供了依据。

6 细胞融合

细胞融合技术是一种将两个不同遗传性的细胞合并为一个杂种细胞的技术, 因此也称细胞杂交技术。它可以用于不同种间、属间、甚至动物、植物细胞之间或动植物与微生物细胞之间的融合。它为构建生物新品种或新的细胞类型提供了一条有效的途径。

在水产生物方面, 该技术具有难以估量的前景。张大力已将长石莼与袋礁膜原生质体融合, 并将融合体培养了20 d, 形成自养细胞团。易泳兰[13]等已把大鳞副泥鳅( 雌) @鳗尾泥鳅( 雄) 杂交囊胚细胞与大鳞副泥鳅卵融合, 培育了1617% 的融合鱼, 其外形兼有双亲的特征, 类似于杂交卵发育的个体[ 18] 。同时他们还将鲤鱼囊胚细胞与红鲫鱼卵融合, 培育了315%的融合鱼苗。这些融合鱼各具两对触须, 形态类似鲤鱼。易泳兰的工作还表明鱼类囊胚细胞与未受精卵的电融合可以简化细胞核移植的操作过程, 1 次可以处理的卵数相当于1 次核移植卵数的2~ 3 倍。可见, 利用细胞融合技术可获得通常难以杂交或不可能杂交的不同物种间的杂交后代, 培养更多更好的新品种。

7 基因工程

基因工程是20 世纪70 年代初兴起的新兴遗传育种技术。1982 年, 科学家首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵中, 获得了个体比对照组大 1 倍的转基因/ 超级鼠0。这为动物基因工程定向育种研究领域显示了新曙光。继转基因超级鼠研制成功后, 转基因猪、免、羊等也相继问世。我国朱作言[14]等首先运用基因转移技术将人的生长激素基因导入泥鳅、银鲫、鲫鱼、鲤鱼受精卵, 使135 日龄泥鳅、208 日龄银鲫和153 日龄镜鲤的体重分别比对照组提高2 ~ 316 倍、718% 和914% , 从而证明了外源基因在受体鱼内的整合、表达和促进生长作用以及通过性腺子代的传递, 建立了完整的转基因鱼模型, 目前, 已先后在金鱼、鲤鱼、鲫鱼、银鲫、泥鳅获得人生长激素基因的转基因鱼。大量研究表明, 该技术在水产生物的品种改良中有巨大潜力。除生长激素基因外, 抗冻蛋白基因、抗病蛋白基因的转移也受到重视。为使缺乏抗冻基因的名贵鱼在寒冷环境中生存, Hew 等把抗冻蛋白基因注射到大西洋鲑受精卵内, 有3% 的个体整合了抗冻蛋白基因。整合的抗冻蛋白基因具有遗传的稳定性和组织表达的特异性, 但表达量受季节影响。整合的转基因鱼中抗冻蛋白的量还不足以产生抗冻效果。今后要通过提高启动子的增强效应或增加基因剂量来加强该转移基因的表达效果。在抗病基因转移方面, 因为鲤与草鱼有很近的亲缘关系, 很多草鱼易患的疾病如出血病、肠炎等不易在鲤鱼中发生, 因此, 张怀云等认为鲤鱼体内具有抗病基因, 因而将鲤鱼作为抗病基因供体, 分离出总DNA, 然后以精子载体导入草鱼受精卵, 获得了体形体色变异的个体。变异了的红色草鱼的获得证明了以总DNA 导入, 也能在鱼类中实现确定性状的转移。有关抗性基因转移方面的研究还有待深入。

从安全性、外源基因的表达强度以及基因产物的生物学效应方面考虑, 鱼类育种方面的基因转移采用的是人生长激素基因、牛生长激素基因, 启动调控顺序使用最普遍的是小鼠的重金属结合蛋白(MT) 基因启动子, 或来自病毒的启动子, 如SV40、RSV 等。用这些元件的重组体培育具有实用价值的转基因鱼是欠妥当的。因为, 这种转基因鱼如释放到天然水体中会不会造成环境污染, 食用这种含