质粒DNA的提取及鉴定

1.1.2 载 体
质粒载体
是染色体外小型的双链环状的DNA，常用载体之一



自我复制 具有合适的限制酶切位点 筛选标记 可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、 产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外 的特性 高拷贝数 小分子量1-200Kb 高稳定性
1.1.2 载 体
质 粒 载 体 的分类
实验操作
Section 2
1.2.1 实验材料
• 含质粒载体（pET28a）和含目的基因质粒 （pEGFP-N3）的大肠杆菌DH5a 溶液I
50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0）
① 每人2个样品，pET28a和pEGFP-N3各一个。 ② 取3µl质粒DNA+1.0µl点样缓冲液，在parafilm 膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔（记住自己 点样位置）。 ③ 接通电泳仪和电泳槽的电源(注意正负极)（→+ ） ④ 恒压150V,电泳10-20分钟 ⑤ 紫外灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片) ⑥ 分析结果。
实 验Biblioteka Baidu一
质粒DNA的提取及鉴定
背景理论知识
Section 1
1.1.1 实 验 目 的
• 掌握质粒信息和用途，学会自己看 质粒图谱 • 掌握快速提取小量质粒DNA的方法 • 了解质粒DNA提取的基本原理
• 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法
1.1.2 载 体
定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。
1.2.2 实验程序
3、质 粒 的 纯 化
① 向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 ② 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另 一离心管（标记！）中 ③ 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1), 反复混匀。
④ 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管 中。
1.2.2 实验程序
负极－
1A1 1A2 1B1 1B2 Marker 2A1 2A2 2B1 2B2
正极＋
实验关键点

溶液I加入后充分悬浮 溶液II一次性加入后轻柔地颠倒混匀 溶液III加入后轻柔地颠倒混匀 酚抽提后小心吸取上清 无水乙醇和70%乙醇不要弄混 微量加样器的正确使用
1.1.3 质粒提取
碱裂解法提取质粒DNA
[目的要求]
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质 粒的方法和技术。
1.1.3 质粒提取 [实验原理]
碱裂解法提取质粒DNA
根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性染色体 DNA 在 拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
• 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽 管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链 仍紧密结合。 • 当加入 pH4.8 的 KAc 高盐缓冲液中和 pH 至中性时，共价闭 合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结 构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等 一起絮状沉淀下来而被除去。
2、细菌裂解及质粒的提取
① 将细胞沉淀悬浮于100ul溶液I中,充分震荡混匀。
② 加200ul溶液II(新鲜配制),盖紧管盖,轻轻混匀 内容物,将离心管放冰上5min。
③ 加150ul溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠 倒数次使混匀。冰上放置10min。 ④ 12000rpm离心10min,将上清转至另一EP管（作 好标记）中。
1.2.2 实验程序
5、质粒的溶解和保存 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰 RNA酶,使DNA完全溶解。 -20℃保存。
1.2.2 实验程序
样品保存
1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3B1 3B2
4 5 6
7
10
8
11
9
12
13
14
•
•
溶液II
0.4 mol/L NaOH， 2% SDS（用前等体积混合）
•
溶液III
5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H2O
1.2.1 实验材料
• 苯酚：氯仿（25：24）
• 氯仿：异戊醇(24：1)
• 无水乙醇， • 70%乙醇(-20C保存) • TE缓冲液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L
根据用途分类
克隆载体 表达载体 pGEM-T, pENTR 原核 pET28a(+), pGEX, pMAL 真核 pcDNA3.0, pEGFP-N3, pRK 穿梭载体
1.1.2 载 体
质粒（原核载体）
1.1.2 载 体
1.1.2 载 体
质粒（真核载体）
1.1.3 质粒提取一般步骤
1. 细菌培养物的生长
2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒DNA的纯化
1.1.3 质粒提取
质粒提取的常用方法
• 碱解法、煮沸法（cDNA、pDNA变性、复 性不同） • 苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺 旋在水相分布） • CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） • SDS 裂解法（高盐浓度下大分子沉淀， 质粒在上清） • 玻璃纤维膜法(试剂盒)
思 考 题
① 分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特 点是什么？ ② 分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ ③ 核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是 什么？ ④ 在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？ ⑤ 纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它 的后期操作有何影响？ ⑥ 有哪些因素影响核酸的沉淀？
移液器（排气式和排液式）
1．选择一支量程合适的移液器 2．设置移液量 3．装枪头 4．检验移液量 5．吸取一定体积的液体 6．目测吸入枪头的液体体积是否合理 7．释放液体 8．退下枪头
实验要求：
• 每人提取质粒2份（pET28a和pEGFP-N3各 一份） • 溶液每大组一套 • 枪每2人一套 • Tips 2人一套（3盒）
EDTA(pH8.0)
• 胰RNA酶
1.2.2 实验程序
1、细菌培养和收集
① 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中， 接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过 夜。（已完成）
② 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管） 中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。
1.2.2 实验程序
1.2.2 实验程序
4、质粒的浓缩
① 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后, 室温放置10-15min。 ② 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心 管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 ③ 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并 离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥5－10min。
类型：大肠杆菌中的质粒、 噬菌体、 M13 噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工 染色体载体及动、植物病毒载体等。
1.1.2 载 体
载体的基本条件




复制子：一段具有特殊结构的 DNA序列，使与 之结合的外源基因复制。 可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反 应。 限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基 因的插入。 适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载 体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。
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1.2.2 实验程序
6、质粒DNA的电泳检测 （1）琼脂糖凝胶的制备 ① 每4人制备一块琼脂糖凝胶（9个泳道） ② 0.2克琼脂糖+20毫升TAE缓冲液，电炉融 胶（充分溶解），稍微冷却加 2µlgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中， 使胶凝固(20min)。
1.2.2 实验程序
（2）琼脂糖凝胶电泳
下次实验
质粒DNA的酶切鉴定 及电泳检测
开始工作吧！
LET’S BEGIN NOW！