酸性森林土壤中酶不同温度敏感性和动力学特征指示C、N、P矿质营养化学计量的季节性转换

酸性森林土壤中酶不同温度敏感性和动力学特征指示

C、N、P矿质营养化学计量的季节性转换

Jirˇ ı´ Ba´ rta• Petra Slajsova ´•Karolina Tahovska•Toma´ sˇ Picek • Hana Santru˚ ckova

摘要

中欧波西米亚酸性森林土壤有机C、N、P的生物地球化学处理过程处于非平衡状态，我们假定这种非平衡状态是由土壤酶活动对不同温度的敏感性差异以及土壤有机质层和凋落物层酶作用底物的亲和性所引起的。为此我们测定了五种主要土壤酶（β-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶、亮氨酸-氨基肽酶、丙氨酸-氨基肽酶、磷酸酶）的潜在活动力。这五种酶对土壤有机C、N、P的获取有很大的影响。同时在连续原位温度测定的基础上我们进行了潜在原位酶活力和营养释放的模型分析。并根据米曼动力学测定了基本动力学参数（Km，Vmax)、酶效能（Kcat）和温度敏感性系数（Ea,Q10），修正了阿列纽斯模型。我们的结果显示在土壤有机质层和枯落物层酶作用底物的亲和性存在着显著差异。枯落物层土壤中氨基态酶的亲和性越高（即较低的Km值），那么缩氨酸化合物愈容易被滤至较低的土层。β-葡萄糖苷酶、磷酸酶在阿列纽斯模型下表现出高温反应。但是两种氨基肽酶在增温过程中都没表现出酶活力甚至还有所下降。这种对温度的不敏感性说明酸性森林土壤中的缩氨酸化合物在较冷较热的时期以一样甚至更低的速率降解。这种非平衡状态导致土壤有机物质和枯落物释放出不同的速效养分，进而影响真菌、细菌群落组成和这些生态系统的营养过程。

关键词酸性森林土壤、酶动力学、潜在酶活力、温度敏感性、土壤酶

引言

土壤酶在C、N、P的生物地球化学循环中发挥着重要作用（Tate 2002）。通过纤维酶、蛋白酶、磷酸酶的水解作用，诸如单糖、磷酸盐、氨等简单有机物就可被释放到土壤环境中。在复杂生物高聚物的降解中通常还需要几类酶配合催化。但是生态学研究往往只量化催化产生同化产物终端反应的酶的活性（Sinsabaugh et al. 2009)却忽视了这些酶的潜在活性能够与生物地球化学转换、微生物新陈代谢联系起来，甚至可以用来预测微生物的营养需求。

在影响土壤酶活性的因素当中，温度、湿度、酶作用底物的有效性是最重要的因素（Meentemeyer1978）。许多研究都集中测定动力学参数，只有一些侧重研究C、N、P获取中土壤酶的温度敏感性(Burns et al. 2002)。相比于大量的研究，土壤有机质降解速率的温度敏感性的研究尤为需要关注(Sinsabaugh et al. 2008）。通过测定基本土壤酶动力学参数，米曼动力模型以及温度敏感性的数据可以使我们更好地了解酶作用底物的潜在有效性。此外，在不同温度下对土壤酶活性以及原位土壤温度的连续测量，我们可以进行原位土壤酶活性模拟并预测整个季节的营养物质释放状况。(Sinsabaugh et al. 2009)。

本次试验旨在对五种参与有机C、N、P化学过程主要酶的动力学参数以及他们在酸性云杉林土壤的温度敏感性进行估计。位于中欧的云杉森林土壤在上世纪后半叶人为施入了大量的N(Kopa′ cˇ ek et al.2002)，这样就打破了土壤生物地球化学过程的平衡(Kopa ′ cˇ ek et al. 2002）。一方面高N输入会对土壤酶生成有积极地反馈，因为他们的生物合成是N密集型的。另一方面，N输入会导致大面积的土壤酸化以及基本阳离子的减少、固氮能力的降低(Majer et al.2003)。这些生物地球化学过程的非平衡性可能是由土壤酶活性的非平衡所致。我们假定这些变化是由土壤有机质层、枯落物层中酶对底物不同的亲和性所造成。同时C、N、P循环中土壤酶不同温度敏感性可以在较温暖和寒冷的季节里转换溶解有机质的化学计量。

我们希望酶活性在上层枯落物层中比土壤有机质层中波动更大。因此假定（1）酶作用底物亲和性随着土壤深度增加而增强，其有效性/浓度下降。（2）根据阿列纽斯模型土壤酶活性将会随着温度升高呈指数性增长（3）土壤酶活性在寒冷时期比在温暖时期里温度敏感性更明显。

材料与方法

样地

我们的样地选在位于北纬48°47′、东经13°52′，海拔1300米的Plesˇ ne湖流域，该区域覆盖有160年的挪威云杉林。基岩为花岗岩。下层林木以发草属、芦草属、蕨类植物为主。土壤类型为雏形土。Kopa′ cˇ ek et al. (2002)对基本理化生物学性质进行了描述。在该湖所在流域的一个实验样地进行土壤采样，样地设置为100*100米。在2010年10月分别在枯落物层（0-2cm）、有几层（5-10cm）取3个重复（每个重复由十个随机采取的土样混合而成）并过3mm筛后在4℃下保存一周。在2010年5月末、8月初、10月末分别采样以进行季节性土壤酶活性的测定。2010年10月采样以测定酶动力学参数和温度敏感性。

土壤酶活性的测定

我们测定了五种参与土壤有机C、N、P过程反应的土壤酶的潜在活性（见表1）。并采用标准荧光技术对酶动力学参数和温度敏感性进行了测定。在100ml蒸馏水中加入1g土壤，取200μL 该悬浮液转移至96井酶标仪，加入50μL MUB或AMC的酶底物。对每个土样分别用MUB/AMC测其标准曲线，浓度梯度设置为0、1、5、10、25、50、100、200μM。酶标仪在30℃下培养2h 。所有的荧光测定都在酶标仪INFINITE F200 (TECAN, Germany)下进行，激发波长为365nm，发射波长为450nm。酶活性单位为nmol h- 1gC- 1

土壤酶动力学参数

用浓度梯度为0，5,25,50,100,200,300,500μM的MUB、AMC底物来测定酶动力参数。酶活性匹配非线性米曼模型，酶效能（Kcat）则通过公式（2）计算。

其中Vmax是酶促反应最大速率，或者限制性同工酶的浓度（nmol min-1g-1）。S是

MUB/AMC浓度，Km是反映对特定底物酶亲和性的米曼常数。

温度敏感性测定和原位模拟

通过在六种不同温度(0, 5, 10, 15, 20, 25 ℃).下测定酶活性我们可以估测每种酶的温度敏感性。MUB和AMC底物浓度则根据动力学结果来进行选择以避免底物局限。酶标仪则放入预先加热或冷却至合适温度的培养箱中2h。125分钟后测定荧光性。

通过公式（3）来计算原位酶活性模拟值。这个修正过的公式曾由Wallenstein et al.( 2009).提出。与Wallenstein公式相反，修正后的公式是基于六种不同温度下酶活性的测定。同时通过安装在试验样地有机质层和枯落物层的仪器来连续记录2010年5月至10月的原位土壤温度。根据每天两小时的温度测定间隔来计算出当天的平均温度、最高、最低温度。可通过修正后的阿列纽斯用平均温度模拟原位土壤酶潜在活性。

通过公式（3）来计算0--25℃范围内的Q10值

其中S是0--25℃用对数ln转换后酶活性线性回归的斜率，，a是转换后酶活性线性回归在Y轴上的截距，是日均温度，e是欧拉值。

启动力（Ea）则可以通过调整潜在酶活性根据非线性阿列纽斯模型计算得出

其中A是碰撞频率（h-1），Ea是酶促反应启动力（Jmol-1），R是气体常数（8.314Jmol-1K-1）。T是绝对温度。

根据C，N，P获取能力不同可将土壤酶活性进行分组(Sinsabaugh et al.2009)。Ec是β-葡萄糖苷酶潜在活性，代表了有机碳的获取能力，En是氨基肽酶平均潜在活性，代表了N的获取能力，Ep是磷酸酶的潜在活性，代表了有机P的获取能力。

当对土壤C，N，P酶催化释放的速效C，N，P进行模拟分析时，我们假定Ec 酶有一个1 mol h-1的理论潜在活性值，以1 mol h-1的速率释放6C葡萄糖。En酶平均释放4.5C和1N。Ep酶释放1P的磷酸盐。这样我们就可以依据公式（6）、（7）、（8）对速效C、N、P的潜在释放量进行模拟。