猪瘟疫苗制备

猪瘟疫苗制备
杨兴辉 11级动物检疫3班 1103108088
1.猪瘟简介
猪瘟（Hog Cholera V accines，HCV）是一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。

其发病特征为发病急，高热稽留和细小血管壁变性，引起全身泛发性小点出血，脾梗死。

是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局列为 A 类动物传染病[1]。

在许多国家和地区，传统疫苗接种是控制猪瘟的重要手段。

2.猪瘟疫苗的发展状况
1903 年De Sehweinitz 和Dorset 首次证明CSFV 是一种滤过性病毒。

1908 年匈牙利Hutyra Koves 制成猪瘟高免血清后，人们一直用高免血清- 血毒同时肌注来免疫猪群。

但由于高免血清昂贵，获取困难，加之血毒有散毒的危险，因此各国学者在以后的60 年间相继研制出许多灭活疫苗。

20 世纪70 年代，在佐剂和病毒培养技术发展的推动下，人们在研制出较为理想的灭活疫苗的同时，还研制出安全有效的猪瘟弱毒疫苗，并广泛应用于临床。

1954 年我国兽医药品监察所周泰冲等研究者，相继用4 株猪瘟病毒(hogcholera virus，HCV) 分别诱发家兔感染，经过一系列的试验，终于选育出1 株能够适应家兔的HCV，经兔体连续传代适应后发生变异，减弱对猪的致病力，却仍保持很强的免疫原性。

用其制备的疫苗自1956 年开始在全国推广应用，对控制我国猪瘟（HC）的流行起到了决定性作用，并在国外广泛应用[2]。

1956 年全国推广兔化弱毒疫苗制成湿苗。

1958年研制成功冻干疫苗。

1965 年，用猪瘟兔化弱毒疫苗接种牛，并感染牛的脾脏和淋巴结，可用来制造牛体反应苗。

1974 年用乳猪肾细胞培养猪瘟兔化弱毒获得成功，因而可利用大瓶旋转培养猪瘟兔化弱毒，制作冻干苗，对猪有效，但用猪肾同源细胞生产疫苗有带猪瘟强毒的危险性。

1980 年研制成功绵羊肾细胞苗。

1982 年和1985 年又分别研制成功了奶山羊肾细胞苗和犊牛睾丸细胞苗。

这些异源苗的研制不但提高了产量，而且在质量上也有所提高[3]。

3.我国猪瘟疫苗使用情况
我国目前市场上使用的猪瘟疫苗主要有4 种，即猪瘟、猪肺疫、猪丹毒三联苗，猪瘟细胞苗，猪瘟乳兔脾淋组织苗，猪瘟成兔脾淋组织苗等，其中免疫效果较好的有2 种，即猪瘟活疫苗（II）———细胞苗、猪瘟活疫苗I———组织苗（成兔脾淋苗）。

这2 种疫苗现在已经是政府采购疫苗,被列入强免名单。

4.猪瘟活疫苗制备工艺流程
1.毒种
1.1制造本品用的毒种为猪瘟兔化弱毒株；校检用强毒为猪瘟病毒石门系。

1.2毒种标准
猪瘟兔化弱毒株
通过兔体继代，采集定型热反应兔的脾脏作毒种。

脾毒应符合以下标准：
（1）对家兔的感染性：将毒种用灭菌生理盐水作50倍稀释，耳静脉接种家兔4只，每只1ml。

接种后测温观察96小时，仅使家兔产生热反应，不致死家兔。

（2）最小感染量：脾毒对家兔的最小感染量≤10-5/ml。

（3）安全性：用灭菌生理盐水作10倍稀释，肌肉注射健康易感猪4头，每头5ml。

接种后每日上、下午各测体温、观察一次，观察21日。

体温、精神、食欲应正常。

（4）免疫原性：脾毒对猪的最小免疫量为≤10-5/ml。

（5）纯净：应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

（6）特异性：将毒种（疫苗）用灭菌生理盐水稀释成每1ml含有100个兔的最小感染量的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10~15℃中和1小时，其间振摇2~3次。

同时设立阳性对照（病毒对照）和阴性对照组（生理盐水）。

中和结束后，分别接种家兔2只，每兔耳静脉注射1ml，观察体温。

除阳性对照组应出现热反应外，其余两组在接种后120小时内不引起热反应。

（7）基础种子代数：为478~490代。

（8）毒种保存-70℃保存期为10年；在-30℃保存期为5年。

2.生产用毒种制备
2.1毒种繁殖
2.1.1家兔的选择选用营养良好，体重1.5~3kg家兔。

购入家兔应隔离饲养观察30日以上。

家兔接种前，至少应测温观察3日，每日上、下午各测温一次。

选用体温正常、体温波动不大的家兔。

2.1.2接种将冻干毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，每兔耳静脉注射1ml。

2.1.3测温观察家兔接种后，上、下午各测温一次，24小时，每隔6小时测体温一次。

2.1.4热型判定接种家兔的体温分为四类：
（1）定型热反应（++）潜伏期24~48小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，至少有3个温次，并稽留18~36小时。

（2）轻热反应（+）潜伏期24~72小时，体温上升有一定曲线，超过常温0.5℃以上，至少有两个温次，稽留12~36小时。

（3）可疑反应（±）潜伏期不到24小时，或超过72小时，或超过72小时以上，体温曲线起伏不定，或稽留不到12个小时，或稽留超过36小时而不下降。

（4）无反应（－）体温正常者。

注：常温家兔接种前3日所测体温的平均温度。

潜伏期：由接种时算起，到体温上升超过常温0.5℃以上的间隔时间。

稽留期：由体温上升超过0.5℃算起，到体温下降到常温或接近常温的间隔时间。

2.1.5毒种的收获
选择定型热反应兔，从体温下降及其以后的24小时内剖杀。

以无菌操作采取脾脏冷冻或冻干保存，作为生产用毒种。

2.2细胞毒的繁殖
用细胞维持液，将新鲜脾毒制成0.3~0.5%的病毒悬液，接种生长良好的牛睾丸或羊肾单层细胞，置36~37℃继续培养。

每隔4~5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产毒种。

2.2.1毒种的鉴定标准
（1）对细胞的感染性毒种接种牛睾丸或羊肾细胞均不致细胞病变。

（2）对家兔的感染性将毒种用灭菌生理盐水作50倍稀释，耳静脉接种家兔4只，每只1ml。

接种后测温观察96小时，仅使家兔产生热反应，不致死家兔。

（3）病毒含量毒种对家兔的最小感染量为≤10-5/ml。

（4）安全性脾毒用10倍稀释乳剂，细胞毒用原液接种无猪瘟中和抗体的健康易感猪4头，每头肌注5ml，测温观察21日，应无异常反应。

（5）纯净毒种应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

符合以上标准的毒种作为生产用种子。

2.2.2毒种保存在-15℃以下保存，脾毒不超过25日；细胞毒不超过6个月。

2.2.3毒种继带脾毒不超过5代；细胞毒不超过3代。

3.制苗用细胞的制备
3.1制苗用细胞为犊牛睾丸或羔羊肾细胞。

牛睾丸或羊肾应选用非猪瘟疫区，无口蹄疫、粘膜病等传染病地区的1~4日龄健康小公牛或10日龄以内的健康羔羊。

3.2细胞的制备
1、牛睾丸的采集和处理犊牛经体表消毒，以无菌手术采取牛睾丸，放入含适宜抗生素的Hank's液或Earle's液中，浸泡30~40
肾盏，将组织剪成1~2mm小块，用Hank's液或Earle's液反复冲洗，至上清液清亮为止。

2、消化将组织块移入消化瓶中，牛睾丸加入5-8倍的0.25%胰酶溶液，塞紧瓶口，
置37℃水浴消化，中间每隔10分钟轻摇一次，消化完毕除去胰酶溶液。

3、细胞分散及培养弃去胰酶溶液后，脱酶1~3次，再加入营养液，以玻璃珠振摇法或吹打法分散细胞，反复进行3~4次，用两层纱布滤过，收取细胞悬液，分装于培养瓶内，装量为瓶容积的1/10，塞紧瓶口，置36~37℃进行旋转培养，转速为每小时10~12转，培养的细胞一般于第3~5日长成致密单层。

4、细胞传代及检验
牛睾丸原代细胞长成单层后，用EDTA-胰酶细胞分散液消化，以（1:3）~（1:5）制成次代细胞悬液，继续旋转培养3~5日，形成良好单层。

同时将次代细胞悬液分装到检验用的小扁瓶和带盖玻片的林氏管中培养，按附注的规定，进行各项检测，应为阴性。

羊肾用原代细胞接毒制苗，同样应将其原代细胞按附注进行各项检测。

3.3制苗毒液的繁殖
3.1接毒取已形成良好单层的牛睾丸次代细胞（羊肾原代细胞）培养瓶，弃去培养液，接种含3~5%生产用细胞毒种或0.2~0.3%脾毒种的维持液，置36~37℃继续培养。

3.2收获接毒后5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液1次。

3.3收获的毒液置-15℃以下保存，应不超过3个月。

1.无菌检验各收次病毒培养液分别取样，应无菌生长。

2.病毒含量测定各收次病毒培养液分别用家兔测定，每1ml应含病毒≥50000个家兔感染量，方可用于配苗。

3.用脾毒接种细胞制备的毒液，应用2头敏感猪做安全检验。

4.配苗及分装
将检验合格的病毒培养液，混合于同一容器内，按一定比例加入5蔗糖脱脂牛奶稳定剂，同时加入适宜的抗生素，充分摇匀，定量分装，每头份含细胞毒液不少于0.015ml。

冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。

轧盖及贴签将冻干后的样品迅速进行轧盖和贴签，放入成品冷库。

5.疫苗的检查
1.物理性状本品为乳白色海绵状疏松团块，易于瓶璧脱离，加稀释液后迅速溶解。

2.无菌检验应无菌生长。

3.支原体检验应无支原体生长。

4.外源病毒检验若生产用毒种和制苗用细胞系统已做过外源病毒检验，成品可免检。

5.安全检验用猪作安检。

按进行。

6.效力检验下列方法任选其一。

1、用家兔效检按瓶签注明头份用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释750倍，耳静脉注射家兔2只，每只1ml。

家兔接种后，上下午各测体温一次，48小时后，每隔6小时测体温一次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。

2、用猪效检按瓶签注明头份，将每头份稀释300倍，肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康易感猪2头，每头1ml。

10~14日后，连同条件相同的对照猪3头，注射猪瘟石门系血毒1ml（10-5最小致死量），观察16日。

对照猪全部发病，且至少死亡2头，免疫猪全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状为合格。

如对照猪死亡不到2头，则重检。

7.剩余水分测定各样品剩余水分均应不超过4.0%。

8.真空度测定如容器内出现白色、粉色和紫色辉光，则真空度合格。

6.作用与用途
用于预防猪瘟，注射4日后，即可产生免疫力。

断奶后无母源抗体仔猪的免疫期为1年。

7.用法与用量
1、按瓶签注明的头份加生理盐水稀释，大小猪均肌肉或皮下注射1ml。

2、在没有猪瘟流行的地区，断奶后无母源抗体的仔猪，注射一次即可。

有疫情威胁时，仔猪可于生后21~30日龄和65日龄左右各注射一次。

3、断奶前仔猪可接种4头剂疫苗。

8.注意事项
1、注苗后应注意观察，如出现过敏反应，应及时注射抗过敏药物。

2、疫苗稀释后，如气温在15℃以下，6小时内用完；如气温在15~27℃，则应在3小时内用完。

贮藏在-15℃以下，有效期为1年6个月。

规格20头份/瓶、40头份/瓶、50头份/瓶、60头份/瓶。

附注：猪瘟细胞培养活疫苗细胞系统的检验
1、细胞培养物应无细菌、霉菌及支原体污染。

2、细胞培养物应无外源性病毒污染。

2、1用显微镜直接观察细胞，应无特异性病变。

2、2用豚鼠红细胞做红细胞吸附试验，应为阴性。

2、3将细胞培养物接种V ero，盲传2代，每代7日，应不出现任何病变。

2、4细胞用猪瘟、牛病毒性腹泻/粘膜病、猪细小病毒（HCV、BVD、PPV）三价荧光抗体对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察，应无特异性荧光。

3、培养细胞用的犊牛血清，用细胞中和试验方法检测牛病毒性腹泻病毒抗体阴性者，方可用于培养细胞。

4、牛肾原代或次代细胞生长液、维持液成分同其他原代细胞。

5、试验所用抗原、阳性标准血清由中监所供给。

6、细胞病变
细胞变长，胞间距离增大，细胞破损脱落。

仅留下细长的或网状的胞质性突起物，直到细胞完全脱离瓶璧。

最特征性的变化是变性细胞核固缩，胞浆中规律地形成大大小小的空泡，空泡直径有些大于1~2倍以上。