第六章 食品中药物残留的检测

（二）其它抗生素也可用此法进行测定，只是 试验的菌种不同或培养基不同。测定青霉素为金 黄色葡萄球菌，链霉素或双氢链霉素为枯草杆菌 （6633），氯霉素为卵黄色八叠球菌（9341）， 新生霉素为白色葡萄球菌。

二、链霉Байду номын сангаас残留量的测定（比色分析法）
（一）原理
在酸性条件下，链霉素可
与二硝基苯肼反应生成黄色的链霉素二硝 基苯腙；多余的试剂经乙酸丁酯提取除去 后，于430nm波长处测吸光度，以标准曲线 求出样品中链霉素的含量。
药物使用后，部分药物被分解或直接排出体外， 另一部分将残留在畜禽体内，这种残留称为药物残 留。 主要残留药物有以下几类： ⒈ 抗生素类药物：天然发酵产物，临床应用最多 的一类抗菌药物。如青霉素类、氨基糖苷类、大 环内酯类、四环素类、螺旋霉素类、链霉素、土 霉素、金霉素类等。 ⒉ 磺胺类药物：抗消炎药，新诺明、磺胺嘧啶、 磺胺眯、是所有动物食品超标最严重的。长期摄 入含磺胺类残留的食物，造成药物在体内蓄积。 排泄以原型或乙酸磺胺经肾排出，在尿中浓度高， 溶解度较低，pH偏酸时，在体内（肾、膀胱内） 结晶，造成泌尿系统损伤。
⑶ 双抗体夹心法测定抗原 将已知特异性抗体吸附于固相表面； 加待测抗原，形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体形成抗体-抗原-抗体复合物； 加底物，底物的降解量与抗原量呈正相关； ⑷ 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固体相载体表面； 加入酶标抗原； 加入酶标抗原和待测抗原； 加底物，样品孔底物降解量与待测抗原量呈负相 关。
三、鲜乳中抗生素残留量的测定（TTC试验）
（一）原理 当乳中含有抗生素时，标准菌株嗜 热链球菌的生长受到抑制，不能将指示剂2,3,5— 氯化三苯基四氮唑（TTC）还原为无色。反之， 当乳中抗生素不存在时，加入的标准菌株，就会 大量生长繁殖，而且将TTC还原为红色化合物。 其红色强度与细菌数量成正比。

本法对各种抗生素的最低检出量：青霉素为 0.004IU/mL，链霉素为0.5IU/mL，庆大霉素为 0.4IU/mL

（二）注意事项 1.本法的正确性与菌种的活力有密切关系。如 菌种活力减弱时，应多次反复传代加强活力。 2.每次检验每个样品应一式二份，另外要作 阴性、阳性对照各2管，阴性对照管作无抗生素 乳9mL，阳性对照管用无抗生素乳9mL加抗生素。 3.水浴培养要避光，保持37℃，水面高于被 检样品，判断要迅速；检样经80℃水浴加热 5min，要严格掌握。 4.制备培养基的乳要绝对无抗生素存在；操 作所用试管、吸管均须经灭菌。
二、药物对食品的污染及危害 (一)药物对食品的污染
1．预防和治疗畜禽疾病
2．作为饲料添加剂使用
3．保鲜：在食品的保鲜过程中，有时加入某种
抗生素以抑制微生物的生长、繁殖，使用后也会
造成对食品的污染。
滥用、不遵守休药期、防腐、添加抗生素 等。超范围使用、使用违禁药物。如：上 海瘦肉精事件、多宝鱼事件、大闸蟹事件。
⑷ 比色：可以用肉眼观察，也可用酶标仪 测定。 ⑸ 结果判断：用“+”或“—”表示，超过吸 收值的标本均属阳性； 直接以吸收值表示，吸收值越大，阳性反 应越强； ③以终点滴度表示：将标本稀释，最高稀 释度仍出现阳性反应，为该标本的滴度。 ④以P/N表示，求出该标本的吸收值与一组 阴性标本吸收值的比值，大于1.5、2、或3 倍即判为阳性。
四环素
氯霉素
磺胺类
呋喃唑酮 盐酸克伦特罗 (瘦肉精） 己烯雌酚
第二节 食品中抗生素的测定
抗生素种类繁多，结构复杂，测定方法各不 相同。因而给检测工作带来了许多困难。抗生素 的测定方法进展很快。主要可分为微生物测定法， 化学测定法和物理测定法三大类。其中以微生物 测定法应用较广。因其测定原理基于抗生素对微 生物的生理机能和代谢作用的抑制，所用试剂数 量少，仪器简单。如牛乳中TTC测定法，肉中四 环素管碟测定法都属于微生物分析法，但这类方 法测定时间较长，且结果误差较大。
酶联免疫法是基于抗原体反应竞争性抑制 进行测定的。微孔板包被有克伦特罗LgG抗 体，经过孵育及洗涤后，再加入竞争性酶 标记物、标准或试样溶液。克伦特罗与竞 争性酶标记物竞争克伦特罗抗体，没有与 抗体连接的克伦特罗标记酶在洗涤步骤中 被除去，加入底物和发色剂到微孔板的孔 中孵育，结合的标记酶将无色的发色剂转 化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜 色转变为黄色。在波长450nm处测量吸光 度值，吸光度值与克伦特罗的浓度的自然 对数成反比。
表5-1 我国食品中部分兽药的最高残留限量
药物 食品 畜禽：肌肉 ≤ 肝 ≤ 肾 ≤ 畜禽肉、水产品 畜禽（可食性组织） ≤ 水产品 ≤ 猪肉、鸡肉、鸡蛋、牛肉≤ 水产品 鸡肉、鸡蛋 ≤ 畜禽肉 畜禽肉、水产品 最高残留限量(mg/kg) 0.1 0.3 0.6 不得检出(检出限0.01) 0.1 0.1(单种） 0.1(以总量计) 不得检出 0.1 不得检出(检出限0.01) 不得检出(检出限0.05)
第三节 食品中激素的测定
由于动物性食品中性激素的含量极微，所以一 般的测定方法受到了限制，较常用的方法有薄层 色谱法、荧光分析法、气相色谱法和高效液相色 谱法等。其中高效液相色谱法具有更大的优越性， 并有取代其它方法之势。

一、性激素总量的测定（薄层色谱法）
（一）原理 样品中的性激素经有机溶剂提 取、浓缩，在硅胶G薄层板上点样、展开后，以 硫酸显色，与标准斑点进行比较，从而达到定性 和半定量的目的。
其药物不能作为畜禽饲料添加剂。世界卫生组织
不主张用链霉素饲喂动物，以免产生耐药性菌株。 （四）要有一定的休药期 所谓的休药期是指食品动物从停止给药到许可 屠宰或它们的产品许可上市的间隔时间。 此时间的规定是根据上述物质在动物体内代谢 的消除率和残留量不致影响人体健康为依据的
四、食品中药物的允许残留量
常用方法：液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫 法。 ⒈ 气相色谱法GC-MS ⑴ 原理 将肉类样品粉碎，用高氯酸溶液匀浆，超 声波加热提取，再用异丙醇-乙酸乙酯（40+60） 萃取，浓缩后经弱阳离子交换柱进行分离，用乙 醇+浓氨水（98+2）溶液洗脱，洗脱液浓缩，经 N,O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后 用GC-MS测定。以1-异丙氨基-3-[对-(2-甲基乙基) 苯氧基]-2-丙醇L(+)-酒石酸盐（美托洛尔）为内标 物，用内标法定量。
ELISA的种类，常用的方法有直接法、间接法、 双抗体夹心法、双夹心法、竞争法。 ⑴ 直接法测定抗原 A .将待测抗原吸附在载体表面； B．加酶标抗体，形成抗原-抗体复合物； C．加底物，底物的降解量与抗原量呈正相关。 ⑵ 间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加待测抗体，形成抗原-抗体复合物； 加酶标二抗（抗抗体）； 加底物，底物的降解量与抗体量呈正相关
⒉ 液相色谱法 原理：样品处理同气相，不用衍生化，外标法定 量。 3. 酶联免疫法 基本原理：酶联免疫吸附测定是在酶免疫技术的 基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其 基本原理是抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和 相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，将待 检样品事先吸附在固相载体表面称为包被，加入 酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附在 固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性结 合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲 液冲掉，当加入酶的地物时，底物发生化学反应， 呈现颜色变化，颜色的深浅与待测抗原或抗体的 量相关，借助分光光度计的光吸收计算抗原（抗 体）的量，也可用肉眼定性观察，因此可定量或 定性的测定抗原或抗体。
三、各种药物的作用原则
（一）合理配伍用药 畜禽发生疾病以后要正确诊断，合理用药，能 用一种药的情况下不用多种药。 （二）按国家规定的范围、剂量使用药物 各国政府都严格规定了各种药物的使用条件。 多数国家规定对生命期短的食用动物禁止应用雌 激素。
（三）使用兽用专用药物
一些国家规定，凡是人类经常使用的抗生素及
常见的几种硅胶吸附剂 硅胶H 硅胶中未加入粘合剂
硅胶G
硅胶S
硅胶中加入粘合剂石膏
硅胶中加入粘合剂淀粉
硅胶HF254 硅胶H中加入波长254nm荧光 物质 硅胶GF254 硅胶G中加入波长254nm荧光 物质
（二）注意事项
1.薄层色谱法可用于性激素的鉴别、半定量测
定以及含量测定前的分离。
⒊ 硝基呋喃类：抗菌消炎。呋喃唑酮、呋 喃西林、呋喃妥因。胃肠道：反应过敏。 我国目前未制定此类药物残留测定国家标 准。 ⒋ 抗寄生虫类：驱虫、杀虫。苯并咪唑、 左旋咪唑、克球酚、吡喹酮；食用此类药 物的食品，潜在危害是致畸、致突变。 ⒌ 激素类药物：提高动物繁殖和加快生长 发育；性激素、皮质激素；以性激素最常 用（已烯孕酮等）。干扰激素代谢和生理 机能，并有一定致癌性，导致儿童早熟、 发育异常，儿童异性趋向。
ELISA测定方法 ⑴ 加样：在ELISA中除了包被外，一般需要进行 4-5次加样。 ⑵ 保温：ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即 加标本侯和加结合物后，此时反应的温度和时间 应按规定要求进行。 ⑶ 洗涤：洗涤在ELISA中不是反应步骤，但是却 决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液 中没有与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反 应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的， 因此在ELISA测定的过程中，应尽量避免非特异 性吸附，在洗涤时又应把这类非特异性吸附的干 扰物质洗涤下来。洗涤如不彻底，特别是最后一 次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值 升高。
2.由于性激素的种类多，故所用的溶剂系统、
吸附剂、展开剂和显色剂不能一概而论。可根据
具体情况，挑选效果最佳者使用。
二 盐酸克伦特罗测定
盐酸克伦特罗商品名称克喘素、息喘宁等， 俗名瘦肉精。化学名称α-[（叔丁氨基）甲 基]-4-氨基-3，5二氯苯甲醇盐酸盐，白色或 类白色的结晶性粉末，无臭、味苦，溶于 水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。化 学性质稳定，一般方法不能将其破坏，加 热至172℃时才分解，含有盐酸克伦特罗的 食品在加工过程中经100℃沸水煮、烧烤、 微波处理等过程，其残留并不减少。
第六章
食品中药物残留 的检测
本章内容
第一节 药物残留的概述 第二节 食品中抗生素的测定 第三节 食品中激素的测定
第一节 药物残留概述
一、药物残留的概念及分类
现代化的畜禽生产中，普遍使用抗生素类药物。在农业 生产上，抗生素可以防治病虫害，刺激植物生长，提高产 量。造成了抗生素在食品中的残留。 为了达到投入少量的饲料而获得更多畜产品的目的，往 往使用激素来促进畜禽的生长发育。常用于食品动物的激 素为性激素具有促进生长发育、增加体重和同步发情等作 用，广泛用于畜牧业生产中，通过饲料添加剂或皮下置入 等方法而摄入牲畜体内，就造成了肉食品中激素残留而影 响人体健康。 食用含有药物残留的食品，使人类的健康受到了极大的 危害，引起了世界各国的关注。因此，对食品中药物残留 情况，必须加以监测，以保证食用安全。

化学测定法和物理测定法则利用抗生素中某些
基团的特殊性质或反应来测定其含量的分析方法。 方法包括比色法、荧光分光光度法、气相色谱法
和高效液相色谱法。
一、四环素类抗生素残留量的测定
食品中四环素类抗生素的测定多采用微生物法。

（一）原理 样品经提取，用离子交换树脂分 离，甲醇溶剂洗脱，经浓缩，残渣用磷酸盐缓冲 液溶解，经荧光鉴定，然后用微生物法进行定量 测定。本方法的最低检出量为0.05mg/kg。
（二）药物的残留对人体的危害 药物虽然有预防和治疗疾病的作用，但同时对 机体也产生有害的作用。药物与毒物之间并无明 显的界限，有些毒物在适当的剂量时具有治疗作 用，而所有药物过量或应用时间过长，均有毒性。 残留的药物对人体的不良影响主要有： 1．毒性作用 2．使某些细菌产生抗药性 3．过敏反应 4．造成菌群失调 5．致癌作用：现已证明残留在食品中的克球 粉、雌激素具有致癌作用。