人源化单克隆抗体制备工艺
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The recombinant hD9 was expressed in HEK-293 cells and purified using an ImmunoPure Protein (L) agarose column.
四、Antigen-binding Affinity Analysis of hD9 五、Therapeutic Efficacy Evaluation of hD9 in vivo 六、Determination of hD9 Half-life in Mouse Serum
LC
75%of the key FR residues of D9 was the same as human donors,22% were different between murine D9 and human donors, but these were conservative (favor or neutral) substitutions in the same groups of amino acids, the remaining 3% (2 residues) were not conserved.
The assignment of antibody international nonproprietary names (INN) is determined by the World Health Organization (WHO), which designates the mAb as chimeric (-xi-),chimeric/humanized (-xizu-), humanized (-zu-), or fully human (-u-).
Siltuximab (Sylvant)
Janssen Biotech
IL-6-specific antibody
Multicentric Castleman's disease
Pembrolizumab (Keytruda)
Merck & Co.
PD1-specific antibody
Metastwk.baidu.comtic melanoma
Green 等人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约 18 Mb 的DNA 全部转到自身抗体基因位点已被清除的小鼠基因组中， 再经过繁育筛选，建立了稳定的转基因小鼠品系。 这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人源抗体。 再用传统的杂交瘤技术，将表达特异抗体的转基因小鼠B 细胞和骨 髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生人源抗体。
全人源化单抗
世界上第一个全人源化单克隆抗体Adalimumab，在2002年12月 被FDA批准用于成年人中重度活动性类风湿关节炎的治疗。
目前制备全人源化单克隆抗体的技术方法主要有：
噬菌体库展示技术 核糖体展示技术 转基因动物法
噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。
——《2016-2020年中国抗体药物市场投资分析及前景预测报告》
天然抗体的产生
抗体的作用：
① 中和作用 ② 激活补体 ③ 调理作用 ④ ADCC
获得性免疫只是个体生命 历程的进化过程，不可遗 传。
人工制备抗体
多克隆抗体（抗血清）
局限性：
特异性不强 易发生交叉反应 制备量少
单克隆抗体
单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为： 鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克 隆抗体。
antibody, HAMA)反应； 3. 且在人体循环系统中很快被清除
因此，在保留对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化 和全人化的改造，减少异源抗体的免疫源性成为单抗研究
的重点。 此外，传统杂交瘤技术还存在制备周期长，成本较高，杂交瘤细 胞不稳定和抗性易丢失等缺陷。
人鼠嵌合抗体
嵌合抗体产生于1980 年代中期，是将鼠源抗体可变区移植到 人抗体恒定区, 应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区 与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细 胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因进行筛选, 得到分泌 人鼠嵌合抗体的细胞株。
随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和 NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的 变种，所以由它们 产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分 子。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于 细胞融合的骨髓 瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
存在的问题：
1. 鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc 受体相关的效应系统； 2. 被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体 (human anti-mouse
—Plos one,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
优点：其一是可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 其二是分离抗体的
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本原理:通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库，同时加入启动子、
鼠源性单克隆抗体
Kohler和Milstein在1975年建立了杂交瘤技术
César Milstein.
Georges Kohler
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方 面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙 二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病 毒的污染问题， 从而得到广泛的应用。
基本原理：用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克
隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库，从 而使该异源分子呈现于噬菌体表面。
制备方法：将抗原包被在固项介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固
定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中 筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的 噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与 恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。
随着技术的进步，虽然引进了重构抗体技术和表面重塑技术以 提高抗体的人源化程度，但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约 30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应（HAMA）。
CDR移植抗体
将鼠源型互补决定区(complementarity determining reign, CDRs) 移植到人源抗体的框架区上。虽然整个移植抗体只有5%的鼠源 性 ，但是鼠源成分依然存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性 问题,而且人源化过程较复杂，造价也比较高。
人源化单克隆抗体制备工艺
神奇的大蛇丸 2016/10/11
抗体是机体在抗原物质刺激下,由B细胞分化成的浆
细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
抗体的历史
1890年，Von Bering 发现了第一种抗体，白喉抗毒素。使白喉患者 死亡率从60%下降到26%。1901年获第一届诺贝尔奖。 20世纪40年代初期，Tiselius和Kabat用肺炎球菌多糖免疫家兔，证 实了抗体活性与血清丙种球蛋白组分相关。 1929年Rodney Robert Porter和Gerald Maurice Edelman解析出了抗 体的分子结构，获得了1972年诺贝尔医学或生理学奖。
核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译 系统中孵育，使目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面，并形成 “mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后通过常规的免疫学检 测方法，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣 的核糖体复合体，再利用RT-PCR 扩增，经过多次循环过程，最终 筛选出高亲和力的目标分子。
The VH of hD9 was further grafted onto the human gamma 1 HC CHs to form a complete HC, while the VL was grafted onto the human kappa 1 LC CL to form a whole LC.
Nivolumab (Opdivo)
Bristol-Myers Squibb
PD1 inhibitor
Unresectable or metastatic melanoma
—2014 FDA drug approvals ,NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY ,2015
Humanization and Characterization of an AntiRicin Neutralization Monoclonal Antibody
The molecular model of D9 Fv was established through
PIGS
二、Humanization of D9
A shortlist of human germline antibody HC or LC V gene candidates with the same CDR canonical structure as the D9 counterpart was then formed to ensure that the human antibody donor FRs support the HC mouse CDR canonical structures.
三、Construction and Expression of hD9
The whole DNA sequence including the human antibody Leader sequence, the humanized LC (VL+CL), 2A linker, leader sequence, and humanized HC (VH+CH1+CH2+CH3), Around 2 kb was synthesized and then cloned into an adenoviral vector for expression in a single open reading frame (ORF) driven by one single promoter.
优点:首先，库容量大，可达到1012 ~1015。其次，在细胞外体系表
达，不需要考虑细胞内毒性。第三，由于核糖体展示技术是完全 体外系统，因此避免了体内体外操作的转换，只通过PCR 就可进 行所有复制与扩增，几个小时就能够建立核糖体展示文库，因此 还具有建库周期短，筛选简便等优势。
转基因小鼠制备全人抗体
四、Antigen-binding Affinity Analysis of hD9 五、Therapeutic Efficacy Evaluation of hD9 in vivo 六、Determination of hD9 Half-life in Mouse Serum
LC
75%of the key FR residues of D9 was the same as human donors,22% were different between murine D9 and human donors, but these were conservative (favor or neutral) substitutions in the same groups of amino acids, the remaining 3% (2 residues) were not conserved.
The assignment of antibody international nonproprietary names (INN) is determined by the World Health Organization (WHO), which designates the mAb as chimeric (-xi-),chimeric/humanized (-xizu-), humanized (-zu-), or fully human (-u-).
Siltuximab (Sylvant)
Janssen Biotech
IL-6-specific antibody
Multicentric Castleman's disease
Pembrolizumab (Keytruda)
Merck & Co.
PD1-specific antibody
Metastwk.baidu.comtic melanoma
Green 等人利用基因打靶技术将编码人抗体轻重链的基因片段大约 18 Mb 的DNA 全部转到自身抗体基因位点已被清除的小鼠基因组中， 再经过繁育筛选，建立了稳定的转基因小鼠品系。 这样得到的转基因小鼠对特异的抗原能产生高亲和力的人源抗体。 再用传统的杂交瘤技术，将表达特异抗体的转基因小鼠B 细胞和骨 髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞系，产生人源抗体。
全人源化单抗
世界上第一个全人源化单克隆抗体Adalimumab，在2002年12月 被FDA批准用于成年人中重度活动性类风湿关节炎的治疗。
目前制备全人源化单克隆抗体的技术方法主要有：
噬菌体库展示技术 核糖体展示技术 转基因动物法
噬菌体抗体库技术
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。
——《2016-2020年中国抗体药物市场投资分析及前景预测报告》
天然抗体的产生
抗体的作用：
① 中和作用 ② 激活补体 ③ 调理作用 ④ ADCC
获得性免疫只是个体生命 历程的进化过程，不可遗 传。
人工制备抗体
多克隆抗体（抗血清）
局限性：
特异性不强 易发生交叉反应 制备量少
单克隆抗体
单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为： 鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克 隆抗体。
antibody, HAMA)反应； 3. 且在人体循环系统中很快被清除
因此，在保留对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化 和全人化的改造，减少异源抗体的免疫源性成为单抗研究
的重点。 此外，传统杂交瘤技术还存在制备周期长，成本较高，杂交瘤细 胞不稳定和抗性易丢失等缺陷。
人鼠嵌合抗体
嵌合抗体产生于1980 年代中期，是将鼠源抗体可变区移植到 人抗体恒定区, 应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区 与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细 胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因进行筛选, 得到分泌 人鼠嵌合抗体的细胞株。
随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和 NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的 变种，所以由它们 产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分 子。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于 细胞融合的骨髓 瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
存在的问题：
1. 鼠源单抗在人体中常不能有效激活补体和Fc 受体相关的效应系统； 2. 被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体 (human anti-mouse
—Plos one,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
优点：其一是可以获得具有人体性质的单克隆抗体, 其二是分离抗体的
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本原理:通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库，同时加入启动子、
鼠源性单克隆抗体
Kohler和Milstein在1975年建立了杂交瘤技术
César Milstein.
Georges Kohler
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方 面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙 二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病 毒的污染问题， 从而得到广泛的应用。
基本原理：用基因工程技术克隆人抗体可变区的全套基因，然后将克
隆的基因插入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬菌体抗体文库，从 而使该异源分子呈现于噬菌体表面。
制备方法：将抗原包被在固项介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与固
定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗脱，从噬菌体库中 筛选出针对特定抗原的特异性抗体的可变区。用表达有相应抗体分子的 噬菌体颗粒去感染宿主菌，使该噬菌体颗粒得到扩增，将抗体可变区与 恒定区组合得到具有完整功能的全人单克隆抗体。
随着技术的进步，虽然引进了重构抗体技术和表面重塑技术以 提高抗体的人源化程度，但这种抗体仍保留了原来鼠源抗体约 30%左右的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应（HAMA）。
CDR移植抗体
将鼠源型互补决定区(complementarity determining reign, CDRs) 移植到人源抗体的框架区上。虽然整个移植抗体只有5%的鼠源 性 ，但是鼠源成分依然存在，并未完全解决鼠抗体的免疫原性 问题,而且人源化过程较复杂，造价也比较高。
人源化单克隆抗体制备工艺
神奇的大蛇丸 2016/10/11
抗体是机体在抗原物质刺激下,由B细胞分化成的浆
细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
抗体的历史
1890年，Von Bering 发现了第一种抗体，白喉抗毒素。使白喉患者 死亡率从60%下降到26%。1901年获第一届诺贝尔奖。 20世纪40年代初期，Tiselius和Kabat用肺炎球菌多糖免疫家兔，证 实了抗体活性与血清丙种球蛋白组分相关。 1929年Rodney Robert Porter和Gerald Maurice Edelman解析出了抗 体的分子结构，获得了1972年诺贝尔医学或生理学奖。
核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录/翻译的无细胞翻译 系统中孵育，使目的基因的翻译产物呈现在核糖体表面，并形成 “mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体，最后通过常规的免疫学检 测方法，通过固相化的靶分子直接从三元复合体中筛选出感兴趣 的核糖体复合体，再利用RT-PCR 扩增，经过多次循环过程，最终 筛选出高亲和力的目标分子。
The VH of hD9 was further grafted onto the human gamma 1 HC CHs to form a complete HC, while the VL was grafted onto the human kappa 1 LC CL to form a whole LC.
Nivolumab (Opdivo)
Bristol-Myers Squibb
PD1 inhibitor
Unresectable or metastatic melanoma
—2014 FDA drug approvals ,NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY ,2015
Humanization and Characterization of an AntiRicin Neutralization Monoclonal Antibody
The molecular model of D9 Fv was established through
PIGS
二、Humanization of D9
A shortlist of human germline antibody HC or LC V gene candidates with the same CDR canonical structure as the D9 counterpart was then formed to ensure that the human antibody donor FRs support the HC mouse CDR canonical structures.
三、Construction and Expression of hD9
The whole DNA sequence including the human antibody Leader sequence, the humanized LC (VL+CL), 2A linker, leader sequence, and humanized HC (VH+CH1+CH2+CH3), Around 2 kb was synthesized and then cloned into an adenoviral vector for expression in a single open reading frame (ORF) driven by one single promoter.
优点:首先，库容量大，可达到1012 ~1015。其次，在细胞外体系表
达，不需要考虑细胞内毒性。第三，由于核糖体展示技术是完全 体外系统，因此避免了体内体外操作的转换，只通过PCR 就可进 行所有复制与扩增，几个小时就能够建立核糖体展示文库，因此 还具有建库周期短，筛选简便等优势。
转基因小鼠制备全人抗体