2.形态学检测

分辨率高 放大倍率
立体感强 适用范围广
低倍镜的使用：
1.对光：转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使 10倍物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光 镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。
2.将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位 移至中央。
3.调焦距：旋转粗调螺旋，升高载物台，至物镜距玻片约 0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。
微 生 物 形 态 学 检 验
样本
涂片染色
初步诊 断报告
预处理
增菌
接种培养基，分离单个菌落 各种鉴定试验
快速诊 断试验
涂片染色 生化试验 血清学实验 动物试验 药敏试验
最终诊断报告
细菌的形态学检查是细菌检验的重要方法之一。 细菌的形态学检查可用于细菌的分类与鉴定，并为进一步 作生化反应、血清学鉴定提供依据。 细菌的形态学检查可迅速了解标本中有无细菌及大致的菌 量并可根据其形态、结构和染色性初步确定其种属，对及 时治疗疾病有一定参考意义。 细菌的形态学检查还看根据形态特征对少数细菌作出初步 诊断，如痰中的抗酸杆菌和脑脊髓液中的脑膜炎奈瑟菌等； 细菌的形态学检查还可验证培养物是否为纯种。
普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般 细菌均能清楚看到。 暗视野显微镜用于检查不染色的活细菌和 螺旋体的形态及运动观察。 相差显微镜主要用于检查不染色活细菌的 形态及某些内部结构。
① 机械部分：镜座、 镜台、镜臂、镜筒、调焦装 置、载物台（物镜转换器）
② 光学部分：目镜、 物镜、反光镜、聚光镜 放大倍数：
照明系统主要由电子枪和聚光镜组成。 电子枪是发射电子的照明光源，其作用是形成电子束，并 控制电子束的发射，获得一高亮度和高稳定度的照明电子 光源。常用的电子枪由常用的是热阴极三极电子枪，它由 发夹形钨丝阴极、栅极帽和阳极组成。 聚光镜是把电子枪发射出来的电子会聚而成的交叉点进一 步会聚后照射到样品上。 照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平 行度好、束流稳定的照明源。
显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜 座，平贴胸前，以防撞碰。不要只用一只手提取，以防显微镜 坠落，然后轻轻放在实习台上或装入木箱内。
显微镜放到实习台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳， 切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微 调节器的装置易损坏。
每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现 问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移 动有关机械部分。
观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组 成。
电镜通过显像管的荧光屏把电子所成的像 转换成光学影像后供肉眼观察。
电子感光板是常用的记录手段之一，可以 利用照相机在照相室内拍照。
透射电镜（Transmission electron Microscope，TEM） 扫描电镜（Scanning electron Microscope，SEM ） 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope, STM） 超高压电子显微镜
电子透镜：能使电子束聚焦的装置 电子透镜是电镜的核心部件，其工作方式是利 用复杂的电极和线圈结构形成静电场和磁场。 电子透镜存在各种像差（aberration），这是 影响成像质量的主要因素。
电子源
电子轨迹 铜导线
软铁壳
焦点 软铁壳
真空系统主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动 控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空 度指示的真空测量规等组成。 供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜 电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。 机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、 制冷系统及控制工作台等，这些部分都有着相当高 的性能。
激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光 扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用 计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧 光图像。
共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦 平面上的每一点扫描，由于照明孔与检测孔相对于物镜焦平面 是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面 以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学 切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。
照明系统
电子枪 聚光镜
成像系统 放大系统
物镜 中间镜 投影镜
纪录系统
样品台的作用是承载样品，并使样品能作平移、倾斜、旋 转，以选择感兴趣的样品区域或位向进行观察分析。
消像散器可以是机械式的，可以是电磁式的。机械式的是 在电磁透镜的磁场周围放置几块位置可以调节的导磁体， 用它们来吸引一部分磁场，把固有的椭圆形磁场校正成接 近旋转对称的磁场。电磁式的是通过电磁极间的吸引和排 斥来校正椭圆形磁场的 。
镜检：先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到 菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中央。由于菌体 是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以 增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运 动还是分子运动（即布朗运动）。
毛细管法属于不染色标本检查 法的一种，主要用来检测厌氧菌的 动力。
酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳 电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电 时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红）
A 透射式
B 落射式
透射式 • 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 暗场聚光镜 • 吸收滤色镜
落射式 • 汞灯光源 • 激发滤色镜 • 分色镜 • 吸收滤色镜
吸收滤色镜 暗场聚光镜
汞灯箱 激发滤色镜
紫外线保护罩 分色镜
吸收滤色镜 激发滤色镜
孔径光栏（FS） 视场光栏（AS）
汞灯
倒置显微镜(Inverted Microscope)的组成和普通显 微镜一样，只不过物镜与照明 系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，用于观察 培养的活细胞，具有相差物镜。
细胞中的某些物质（如叶绿素）经紫外线照射后能发出可见光线， 称为荧光。
自发荧光：由细胞本身存在的物质经紫外线照射后发出的荧光。
诱发荧光：一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧 光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色 或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发 荧光。
相同和两束光的光强度大小一致这两
个基本要求。
数值孔径
镜筒长度 盖玻片厚度
透镜
镜头
低 目倍 镜高
倍
低 物倍 镜高
倍
透镜大小 大 小 大 小
镜头长短 长 短 短 长
视野亮度 亮 暗 亮 暗
物像大小 小 大 小 大
细胞数 多 少 多 少
荧光显微镜 是以紫外线为光源来激发生物标本中的荧光物质， 产生能观察到各种颜色荧光的一种光学显微镜。利用它可研究荧 光物质在组织和细胞内的分布。为防止紫外线进入物镜，可以采 用暗视场照明。
油镜的使用
使用前必须对所用显微镜进行详细检查
调光：检查未染色标本时，以弱光线为宜，此时可将集光 器下降或缩小光栅，检查染色标本时，以光线强为宜，此 时应适当升高集光器或将光栅打开。
用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至视野中央， 在标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将 油镜头对准镜台孔，使油镜头下端与镜油接触，然后，轻 轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光 镜的光圈充分开大。 用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗 剂，将镜头和玻片擦净。
制备菌液：从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有1－2ml无菌 水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液。
涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的 凡士林。
滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用削尖的记号 笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻 找菌液的位置。
盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻 轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后翻转凹玻片， 菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周 边缘闭合，以防菌液干燥。
在显微镜载物台上加一个微量步进马达，使载物台上下移动， 改变焦平面，不同层次的光切面图像经计算机图像三维重组， 就能获得样品的立体结构图像。
抑制图像的模糊，获得清晰的图像 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切 片 增加侧向分辨率 由于点对点扫描去除了杂散光的影响
细胞的三维重建 细胞定量荧光测定 细胞内钙离子、pH值和其它离子的动态分析 细胞间通讯和膜的流动性
目镜的放大倍数×物镜的 放大倍数
双目显微镜(binocular microscope)
目镜 的结构是利用一组复合棱镜把透过物
物镜 镜后的光束分成强度相同的两束而形
成两个中间像，分别再由左右目镜放
聚 大。来自物镜的光线经棱镜组分光成 光 两束平行光束，进入目镜，双目显微 器 镜必须满足分光后两束光的光程必须
显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不 洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭 去。
显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成 “八”字形，转动粗调节器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器 相碰。
应用：主要用于观察活菌的动力和运动方式。 常用方法：压滴法、悬滴法、暗视野映光法。
暗视野显微镜（dark field
microscope）的聚光镜中央有档
暗 视
光片，使照明光线不直接进入物
野
镜，只允许被标本反射和衍射的
照
明
光线进入物镜，因而视野的背景
方
是黑的，物体的边缘是亮的。利
式
用这种显微镜能见到小至 4nm-
200nm的微粒子，分辨率可比普
通显微镜高50倍。
激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 原 理 图
显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。 把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜 （object lens），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透 镜组称为目镜（ocular lens）。被观察物体位于物镜的 前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实 像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的 虚像，位于人眼的明视距离处。
在透射电子显微镜中有许多固定光阑和可动光阑，它们的 作用主要是挡掉发散的电子，保证电子束的相干性和照射 区域。
主要优点：分辨率高，可用来观察组 织和细胞内部的超微结构以及微生物 和生物大分子的全貎。
扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样 品，在样品表面激发出次级电子， 次级电子由探测体收集，并在那 里被闪烁器转变为光信号，再经 光电倍增管wk.baidu.com放大器转变为电信 号来控制荧光屏上电子束的强度， 显示出与电子束同步的扫描图像。
灯丝
聚光镜用来会聚电子枪射出的电子束，以最小 的损失照明样品，调节照明强度、孔径角和束 斑大小。一般都采用双聚光镜系统。第一聚光 镜是强激磁透镜，束斑缩小率为10～50倍左右， 将电子枪第一交叉点束斑缩小为1～5μm；而第 二聚光镜是弱激磁透镜，适焦时放大倍数为2倍 左右。结果在样品平面上可获得2～10μm的照 明电子束斑。
压滴法
压滴法属于不染色标本检查法 的一种，可以用来检测细菌的动力。
将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放—小滴 无菌水。 将酒精灯放于自己正前方，点燃。 用无菌操作方法从斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴 充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。 用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液．然后将 整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。如菌液过多， 可用吸水纸适当吸去一部分。 先用低倍镜然后转用高倍镜观查，观察时光线要适当调暗 些。
4.调节两瞳孔间的距离：一边用双眼自目镜中观察，一边用双 手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视 野为止。
5.为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像 清晰，需旋转镜管长度调节环。
高倍镜的使用：
用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的 结构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋 转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高 聚光镜，将光线调节到最亮的程度；然后，稍 微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。
光镜分辨极限为0.2m，小于0.2m的微细结构的光波 可产生衍射现象,这种光波经过物体时可绕过物体就 象无物体经过一样,因此无法用光镜观察。这就需要 一种更大分辫力的仪器来观察比0.2m更小的物体的 微细结构。 电子显微镜由电子光学系统（照明系统、成像系统）、 真空系统、供电系统、机械系统和观察显示系统组成。