结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍
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结核分枝杆菌分子生物学检测技术介绍
分子生物学检测技术适用范围
结核分枝杆菌分子生物学检测适用于结核患者或疑似结核患者临床采集标 本的检测，与痰涂片、培养等病原学检测互为补充，提高结核病诊断的准 确性和及时性。
结核分枝杆菌复合群（MTBC）由人型结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分 枝杆菌、田鼠分枝杆菌、canettii分枝杆菌、caprea分枝杆菌和 pinnipedii分枝杆菌组成。各成员基因组序列具有高度的同源性，目前临 床分子生物学检测中一般仅检测MTBC存在与否。
广州华峰LAMP
1. 引入一种核酸染料，实现直接用肉眼对实验结果判定。 2. 自行创新设计LAMP反应容器，实现核酸扩增后不开盖判读检测结果。
“分格式PCR管”的一个分隔腔中预装有SYBR Green I荧光染料，在反应结束后，颠倒摇动 PCR管数次，根据反应液颜色变化，肉眼判读 试验结果，绿色为阳性，棕红色为阴性。
Xpert MTB/RIF检测技术
GeneXpert检测系统由美国Cepheid公司研发，完全整合了传统PCR 检测所需的三个步骤。
六大特性：集成性、快捷性、灵活性、易操作、安全性和精确性。
GeneXpert 反应盒
GeneXpert检测采用完备独立的反应盒。 反应盒支持多种上样体积，可以方便的 获得进行PCR反应所需的足够浓度的反 应模板量。
2
交叉引物设计
5’
置换引物
wenku.baidu.com3’ 5’
交叉引物 1
交叉引物 2
5’ 3’
置换引物 5’
BST DNA 聚合酶 具有链置换功能
全封闭式核酸扩增产物快速检测装置
免疫层析显色法技术：核酸检测试纸条包被上特异性的核酸纳米级胶体金颗粒和特 别标记的核酸探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线 （T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩 增产物与标记物连接，结果无显色。
PURE TB-LAMP试剂盒相比于第一代试剂盒，整个手工操作步骤减
少1/3，所有反应只需在一个加热装置内即可完成，操作更加方便并降
低了污染发生的可能性。
核酸: 未吸收 扩增抑制剂: 吸收
标本
混合
多孔吸附剂
前处理液 干燥的LAMP反应试剂 日本荣研LAMP二代试剂盒
LAMP 反应
PURE TB-LAMP反应所需设备、试剂耗材及操作流程
广州迪澳LAMP
三种LAMP检测试剂盒比较
荣研
华峰
迪澳
样品前处理及 简易装置进行痰标本 手工痰标本液化处理，手工痰标本液化处理，
核酸提取
前处理及核酸提取 煮沸法提取核酸
煮沸法提取核酸
反应温度/时间
67℃/40min
65℃/60min
63℃/30min
操作流程
装置提取核酸后直接 加入到反应管进行扩 增反应。
Xpert MTB/RIF检测原理
Xpert MTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司GeneXpert检测系统，是一种 半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心 区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者 是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）。
2007
•华峰LAMP检测试剂盒
2005
•日本荣研，结核分枝杆菌LAMP一代检测试剂盒
2003 2002
•Iwamoto, 结核分枝杆菌gyrB基因
日本荣研LAMP一代试剂盒
钙黄绿素与试剂中的锰离子结合处于猝灭状态。 扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释 放钙黄绿素，猝灭状态解除，发出黄绿色荧光。
闭扩增产物。
产物。
产物。
是
否
是
交叉引物恒温扩增检测（CPA）
模板序列和交叉引物设计
生物素标记探针
5’AGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATG3’
核酸提取后，需配制 分装反应液（复溶液 和石蜡油），然后进 行加样。
核酸提取后，需配制 分装反应液（聚合酶 和密封液），然后进 行加样。
结果判读 颜色变化，肉眼观察 颜色变化，肉眼观察 仪器自动判读结果
污染控制 专用仪器
核酸提取无需开盖， 核酸提取和加样均需 核酸提取和加样均需
加样需开盖，完全封 开盖，完全封闭扩增 开盖，完全封闭扩增
环介导等温扩增检测（LAMP） 交叉引物恒温扩增检测（CPA） Xpert MTB/RIF检测
环介导等温扩增检测（LAMP）
靶基因
六个特异 部位
四条引物
LAMP在结核病检测中的进展及前景
2012 • 华峰环介导恒温扩增检测试剂盒
2011
• 迪澳恒温荧光法检测试剂盒
2010
2009 • 迪澳LAMP检测试剂盒 2008 •极速DNA提取LAMP检测试剂（PURE-LAMP）
GeneXpert 反应模块
GeneXpert模块是一个独立，可控 温的荧光计，可对进行中的PCR反应 进行实时监测。该模块可快速精确地 控制反应样品温度，保障反应的快速、 精确进行。
每一个模块都具有六个光谱，这使 模块可检测一个反应管中的多种荧光 染料。
每一个反应单元都相互独立。传统 PCR仪将所有样品都置于相同的时间、 温度、光学程序中，GeneXpert系统 中的每一个样品都拥有各自不同的程 序。
正向引物位点 1
特异性模板序列
FitC标记探针
逆向引物位点 2
2
1
正向交叉引物 1: 5’-CATACTCTTCCACATGACGCAGGGACATAACAATGGTATTTG-3’
逆向交叉引物 2: 5’-AGGGACATAACAATGGTATTTGCATACTCTTCCACATGACGC-3’
1
分子生物学检测技术主要分类
PCR技术：通过控制温度的变化来实现DNA扩增，包括模板变性 （95℃）、 引物杂交（58℃）和DNA合成（72℃） 。
恒温扩增检测技术： DNA在60 ～ 65℃处于动态平衡状态，任何一个引物 向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单 链。
分子生物学检测技术适用范围
结核分枝杆菌分子生物学检测适用于结核患者或疑似结核患者临床采集标 本的检测，与痰涂片、培养等病原学检测互为补充，提高结核病诊断的准 确性和及时性。
结核分枝杆菌复合群（MTBC）由人型结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分 枝杆菌、田鼠分枝杆菌、canettii分枝杆菌、caprea分枝杆菌和 pinnipedii分枝杆菌组成。各成员基因组序列具有高度的同源性，目前临 床分子生物学检测中一般仅检测MTBC存在与否。
广州华峰LAMP
1. 引入一种核酸染料，实现直接用肉眼对实验结果判定。 2. 自行创新设计LAMP反应容器，实现核酸扩增后不开盖判读检测结果。
“分格式PCR管”的一个分隔腔中预装有SYBR Green I荧光染料，在反应结束后，颠倒摇动 PCR管数次，根据反应液颜色变化，肉眼判读 试验结果，绿色为阳性，棕红色为阴性。
Xpert MTB/RIF检测技术
GeneXpert检测系统由美国Cepheid公司研发，完全整合了传统PCR 检测所需的三个步骤。
六大特性：集成性、快捷性、灵活性、易操作、安全性和精确性。
GeneXpert 反应盒
GeneXpert检测采用完备独立的反应盒。 反应盒支持多种上样体积，可以方便的 获得进行PCR反应所需的足够浓度的反 应模板量。
2
交叉引物设计
5’
置换引物
wenku.baidu.com3’ 5’
交叉引物 1
交叉引物 2
5’ 3’
置换引物 5’
BST DNA 聚合酶 具有链置换功能
全封闭式核酸扩增产物快速检测装置
免疫层析显色法技术：核酸检测试纸条包被上特异性的核酸纳米级胶体金颗粒和特 别标记的核酸探针，使扩增后的检测产物和胶体金颗粒结合，在试纸条的检测线 （T线）上显色来检测DNA扩增产物；如果无目标DNA，特异性探针则将无法把扩 增产物与标记物连接，结果无显色。
PURE TB-LAMP试剂盒相比于第一代试剂盒，整个手工操作步骤减
少1/3，所有反应只需在一个加热装置内即可完成，操作更加方便并降
低了污染发生的可能性。
核酸: 未吸收 扩增抑制剂: 吸收
标本
混合
多孔吸附剂
前处理液 干燥的LAMP反应试剂 日本荣研LAMP二代试剂盒
LAMP 反应
PURE TB-LAMP反应所需设备、试剂耗材及操作流程
广州迪澳LAMP
三种LAMP检测试剂盒比较
荣研
华峰
迪澳
样品前处理及 简易装置进行痰标本 手工痰标本液化处理，手工痰标本液化处理，
核酸提取
前处理及核酸提取 煮沸法提取核酸
煮沸法提取核酸
反应温度/时间
67℃/40min
65℃/60min
63℃/30min
操作流程
装置提取核酸后直接 加入到反应管进行扩 增反应。
Xpert MTB/RIF检测原理
Xpert MTB/RIF核酸检测采用Cepheid公司GeneXpert检测系统，是一种 半巢式实时荧光定量PCR体外诊断技术，针对rpoB基因81bp利福平耐药核心 区间（RRDR）设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断患者 是否结核以及是否对利福平耐药（rpoB序列存在突变）。
2007
•华峰LAMP检测试剂盒
2005
•日本荣研，结核分枝杆菌LAMP一代检测试剂盒
2003 2002
•Iwamoto, 结核分枝杆菌gyrB基因
日本荣研LAMP一代试剂盒
钙黄绿素与试剂中的锰离子结合处于猝灭状态。 扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释 放钙黄绿素，猝灭状态解除，发出黄绿色荧光。
闭扩增产物。
产物。
产物。
是
否
是
交叉引物恒温扩增检测（CPA）
模板序列和交叉引物设计
生物素标记探针
5’AGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATG3’
核酸提取后，需配制 分装反应液（复溶液 和石蜡油），然后进 行加样。
核酸提取后，需配制 分装反应液（聚合酶 和密封液），然后进 行加样。
结果判读 颜色变化，肉眼观察 颜色变化，肉眼观察 仪器自动判读结果
污染控制 专用仪器
核酸提取无需开盖， 核酸提取和加样均需 核酸提取和加样均需
加样需开盖，完全封 开盖，完全封闭扩增 开盖，完全封闭扩增
环介导等温扩增检测（LAMP） 交叉引物恒温扩增检测（CPA） Xpert MTB/RIF检测
环介导等温扩增检测（LAMP）
靶基因
六个特异 部位
四条引物
LAMP在结核病检测中的进展及前景
2012 • 华峰环介导恒温扩增检测试剂盒
2011
• 迪澳恒温荧光法检测试剂盒
2010
2009 • 迪澳LAMP检测试剂盒 2008 •极速DNA提取LAMP检测试剂（PURE-LAMP）
GeneXpert 反应模块
GeneXpert模块是一个独立，可控 温的荧光计，可对进行中的PCR反应 进行实时监测。该模块可快速精确地 控制反应样品温度，保障反应的快速、 精确进行。
每一个模块都具有六个光谱，这使 模块可检测一个反应管中的多种荧光 染料。
每一个反应单元都相互独立。传统 PCR仪将所有样品都置于相同的时间、 温度、光学程序中，GeneXpert系统 中的每一个样品都拥有各自不同的程 序。
正向引物位点 1
特异性模板序列
FitC标记探针
逆向引物位点 2
2
1
正向交叉引物 1: 5’-CATACTCTTCCACATGACGCAGGGACATAACAATGGTATTTG-3’
逆向交叉引物 2: 5’-AGGGACATAACAATGGTATTTGCATACTCTTCCACATGACGC-3’
1
分子生物学检测技术主要分类
PCR技术：通过控制温度的变化来实现DNA扩增，包括模板变性 （95℃）、 引物杂交（58℃）和DNA合成（72℃） 。
恒温扩增检测技术： DNA在60 ～ 65℃处于动态平衡状态，任何一个引物 向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单 链。