佐剂的研究现状

佐剂的研究现状
【摘要】随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展,对佐剂的研究显得越来越重要，本文通过查阅近几年相关文献，综合免疫佐剂研究多方面资料和最新观点，就免疫佐剂研究概况作一综述，着重介绍几种新型的佐剂的特点，并就其发展趋势提出自己的见解，为开发研制高效、低毒、结构新颖的免疫佐剂提供参考。

【关键字】免疫佐剂研究
佐剂是先于抗原或同时注射于动物体内，能非特异性地改变机体对抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质，又称免疫佐剂。

从巴斯德至今近百年来已开发了许多菌苗和疫苗，但传统的菌疫苗一般多为全菌或全病毒制成，其中含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也有佐剂作用，所以一般不需要外加佐剂。

因此,在这段时间里免疫佐剂并未引起人们广泛的注意，直到1925年，法国免疫学家兼兽医Gaston Ramon发现在疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗反应[1]，从此许多国家都不同程度的开展了这方面的研究。

现在,由于高度纯化的新型疫苗的生产技术不断取得突破，而常规的佐剂由于其自身的缺陷使之很难适应新型疫苗的发展，因此新的研究工作已经逐渐引起科研工作者的注意。

20世纪60年代，原苏联喀山医学院就对蜂胶影响动物机体免疫活性方面进行了观察，通过对小鼠、豚鼠、家兔等实验证明应用蜂胶或配合抗原进入机体，能促进机体免疫过程。

1981年Kreuter首次将纳米材料应用于疫苗佐剂，证明纳米粒子佐剂既能提高细胞免疫，又能提高体液免疫。

1998年Moldoveanu 等最早报道CpG ODN 联合灭活流感病毒免疫小鼠能诱导产生比常规佐剂更高的血清特异性抗体。

这些新型佐剂能克服常规佐剂的一些缺陷，因而受到国内外学者越来越多的关注。

目前我国常用的佐剂有铝盐、油乳、蜂胶、多糖、微生物、氟氏（FA）佐剂、γ- 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素(Interleuki-ns，ILs)、免疫刺激复合物（ISCOMs）、糖苷及复方中药佐剂等，新型免疫佐剂有核酸、CpG、补体、纳米、脂质体（LIP）等。

下面就几种免疫佐剂的研究现状和应用前景进行简要的综述。

1 佐剂作用机理
Cox[2]等提出了佐剂增强免疫应答5种可能的机制:
1.1 免疫调节作用
众多佐剂具有调节细胞因子网络的能力。

不同的佐剂诱导抗原提呈细胞分泌不同的细胞因子，促使Th前体细胞向Th1或Th2不同的亚型分化。

1.2 抗原提呈作用
某些佐剂能保持抗原构象的完整性，并将其呈递给合适的免疫效应因子。

当佐剂与抗原以更有效的维护构象表位的方式结合时，可提高抗原的体内作用,延长抗原屏蔽时间.
1.3 诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)
应答通过与细胞膜融合或保护抗原肽，佐剂可促进相应肽掺入MHC类分子并维持二者结合，同时期望通过诱导IFN-γ和TNF-α来提高肽MHC类分子的表达。

1.4 靶向作用
指佐剂通过激发APC摄取和传递抗原，进而向免疫效应细胞提呈免疫原的能力。

此种调节有助于免疫系统获得足量免疫原以达到预期的免疫效果。

1.5 抗原贮存作用
以铝佐剂和油包水佐剂为代表的短期贮存，可将抗原捕获在注射部位免受肝脏清除，像合成多聚体微球等长期贮存的佐剂，可贮存抗原以提供持续和脉冲式释。

而纳米佐剂增强疫苗免疫应答的作用机制尚未清楚,可能与以下机制有关：纳米粒子与疫苗抗原的结合方式、结合比例等对疫苗抗原有保护性作用，保护抗原免受机体各种酶的降解；抗原物质与纳米粒子结合后更有利于被APC靶向摄取(纳米佐剂和抗原组成的超小体积的微粒是巨噬细胞、树突状细胞的首选吞噬目标；长效缓释，随着纳米佐剂粒子的降解,抗原可持续释放。

对于纳米佐剂的作用机制需进一步研究，因为只有弄清作用机制后，才能根据其机制找到佐剂最大免疫刺激作用和最小不良反应的平衡点，将纳米佐剂安全有效地应用于人体。

2·几种新型佐剂的特点
2.1 脂质体（LIP）
LIP 是人工合成的双分子层的单层磷脂或多层可溶性物质隔开的呈同心圆的微环体脂质小囊，可包裹各种物质及疫苗，该载体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构，在体内趋向于沉积在肝、脾、淋巴结等网状内皮巨噬系统中，它既是抗原也是免疫佐剂，由于其膜结构致密，抗原不易漏出，能长久的将抗原传递给适免疫细胞，促进抗原对抗原提呈细胞的定向作用。

LIP 既无毒性，又无免疫原性以及在体内的可降解性，不会在体内引起类似弗氏佐剂所引起的损伤，是一种优良佐剂[3]。

刘湘涛等报道用LIP 与禽多杀性巴氏杆菌的主要保护性抗原荚膜多糖（CPS）配制的疫苗比用油乳剂、明矾及金黄色葡萄球菌免疫复合物为佐剂的效果好。

Novasomes 是目前研制的一种新型脂质体样系统用于黏膜免疫，该系统为非磷脂亲水脂分子，在体内稳定性比常规LIP 好，而且价廉、易制备，是一种很好的免疫佐剂。

2.2 纳米粒子佐剂
纳米粒子能穿透组织间隙，也可通过机体最小的毛细血管，且分布面极广，易被消化和吸收，从而可最大限度的提高利用率。

而且包裹或表面结合抗原的纳米粒子能使蛋白抗原的表面充分暴露，同时使抗原结构更稳定，能促进淋巴集结的摄取，在体内能引起强烈的特异性免疫反应。

大量的实验都表明，纳米粒子佐剂可有效提高细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫。

美国密歇根州大学生物纳米科技中心，将小鼠免疫流感病毒A和纳米乳剂的混合物免疫小鼠，20 d 后用致死剂量的流感病毒感染小鼠，结果免疫动物受到了完全的保护，而接种了甲醛灭活病毒或纳米乳剂的小鼠，则发展为病毒性肺炎，6 d后死亡[4]。

Stieneker 等发现聚甲基丙烯酸甲酯纳米粒子对大鼠体内的AIDS疫苗起辅助作用时，与氢氧化铝辅助作用相比，抗体的滴度要高出100～1 000倍[5]。

在国内，何萍,吕凤林等人通过自制纳米铝佐剂，研究其对乙型肝炎病毒和狂犬病毒体液免疫应答的影响。

结果纳米铝佐剂在诱导HBsAg 和Rabies疫苗体液免疫应答的早期优于常规铝佐剂, 能够快速地激活和提高小鼠和豚鼠的免疫应答和应答水平[6]。

钟石根等将钙纳米粒子
与NP30 制备成Ca-NP30 结合物, 免疫小鼠后发现钙纳米粒子可增强NP30对宿主的保护性作用，减虫率明显提高[7]。

柴家前等通过专门技术制备纳米蜂胶颗粒(NPP)，发现NPP使雏鸡血液中的T 淋巴细胞比率和RBC2C3bR花环率都极显著增加, 而RBC2IC花环率显著降低[8]。

纳米佐剂是目前研究的热点，它可避免传统疫苗的载体效应发生，还可提高生物利用度，提高制剂的均匀性、分散性和吸收性，具有较理想的免疫增强作用。

2.3 复合佐剂
研究表明，单独使用抗原或仅应用某一种佐剂，对改善抗原的反应强度、免疫力维持时间、免疫耐受等作用有限，而使用复合佐剂的疫苗比使用单一佐剂的疫苗，可以诱导更强的免疫反应，因此，将不同类型佐剂配合研制复合免疫佐剂成为佐剂发展的新趋势。

目前已开发的多种复合佐剂，如中西药复合佐剂，CpG-ODN 和氢氧化铝复合佐剂等，且其中有相当一部分通过动物试验，证明复方佐剂比单一佐剂的免疫增强效果更好。

[9]
大量研究资料证明，中药复方可作为佐剂，具有调节各种免疫细胞活性、细胞因子和抗体水平的作用，能促进特异性免疫活性细胞产生、免疫器官发育、红细胞免疫作用等功能，从而增强疫苗的免疫效果。

复方中药作为免疫增强剂，无论是单独使用或与疫苗的联合使用，都能够显著提高抗体效价。

曹国文等[10]以枸杞子、菟丝子等多味中药研制而成的免疫增强剂中药复方，拌料饲喂鸡传染性法氏囊强毒（IBDV）攻毒后的鸡，试验证明，复方中药能显著增强机体的免疫抵抗力；陈德坤等[11]以黄芪、党参及淫羊藿等中药的提取物制成为复合佐剂，研究其对新城疫Ⅱ系疫苗的佐剂效应，结果表明，疫苗与复合佐剂的联合应用可显著提高免疫鸡的抗体效价及维持时间。

西药复合佐剂，氢氧化锌和低分子量透明质酸均可作为免疫刺激剂。

施建东等[12]在甲肝、乙肝混合抗原中加入不同配比的氢氧化锌和低分子量透明质酸制成复合佐剂，经皮下免疫ICR 小鼠，结果表明LHA 与氢氧化锌按一定剂量配比混合后，甲肝、乙肝混合抗原能诱导体液免疫应答，且在一定剂量、范围和时间内，诱导的免疫增强效应及抗体持续时间优于铝盐佐剂。

也有相关的研究表明硫酸乙酰肝素与氢氧化锌联合佐剂能有效诱导小鼠增强对HBsAg 的特异性反应，诱导小鼠增强对重组HCV 抗原多肽表位疫苗的体液免疫。

中西药复合佐剂，在吕殿红等的研究中，以具有补益功能的黄芪等结合维生素 E 和左旋咪唑(Levamisol，LMS）配制成两组复方免疫增强剂，研究其对鸡免疫抗体的影响。

结果表明中西药联合使用具有免疫促进作用，可充分发挥各自的优势应答。

[13]
复合黏膜免疫佐剂，南京农业大学以CpG DNA 和胆酸钠按质量比为5∶2 混合或配合制成复合佐剂，用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫，实验证明复合佐剂配合禽流感灭活抗原能够有效提高黏膜局部免疫和全身体液免疫力，为禽流感的预防提供了一条较理想的免疫途径[14]。

2.4 CpG序列
CpG序列是指一类以非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为核心的寡聚脱氧核糖核苷酸).CpG序列可激活T细胞、B细胞NK细胞等免疫活性细胞,产生大量的多种细胞因子,增强机体的特异性和非特异性免疫效应.CpG序列作为免疫佐剂有如下特点: (1)与常用的氢氧化铝佐剂具有协同作用; (2)一些能与铝混合的减毒活疫苗或多价疫苗则可单独使用CpG-ODN增强
其免疫原性; (3)应用范围广.其表现有两方面,一方面, CpG作为疫苗佐剂,能增强鸡蛋溶菌酶、卵白蛋白、肿瘤抗原、传染性乙肝疫苗和流感疫苗等抗原的免疫效果,能加强不同DNA疫苗免疫反应;另一方面, CpG的免疫佐剂作用在小鼠和灵长类中均已得到证实。

许洪林[14]等人通过体外试验确定了研究人CpG-ODN的动物模型,评价了人CpG-ODN在动物模型中对HbsA疫苗佐剂活性;据报道,目前CpG作为人乙肝疫苗佐剂已进入临床试验.虽然CpG-ODN具有安全、有效等优点,但是还是有许多的问题有待于解决,如它的免疫激活机制、免疫剂量(实验表明,高剂量CpG-ODN及重复给药能导致毒性效应)和最适免疫途径还需要进一步研究.
2.5补体分子佐剂
补体C3分子是连接机体天然免疫和获得性免疫的桥梁之一。

最近有人用C3d 分子作为佐剂来增强DNA免疫应答。

C3d与特异性受体CR2结合后, 能提供共刺激信号,促进B细胞活化,促进抗体的亲和性成熟,维持免疫记忆,对机体的免疫反应有很强的正调控作用。

Suradhat等将1~2个C3d编码基因与2种不同抗原编码基因———牛轮状病毒VP7或牛1型疱疹病毒糖蛋白(gD)基因重组，免疫小鼠后发现1个拷贝C3d抑制了特异性抗体水平，2个拷贝的C3d分子效果更加明显，脾细胞中抗原特异性IFN-r、IL-4分泌细胞的频率也有明显的降低。

Ross等将禽流感病毒HA的胞外段与3个C3d融合起来构建成sHA23C3d,免疫小鼠后发现抗体滴度和抗体亲和力增加, 用病毒攻击后,肺部的病毒量比单独注射HA减少了10倍。

将麻疹病毒血凝素基因H和3个C3d基因融合构建成质粒sH23C3d,免疫小鼠后,发现抗体滴度提高,明显的抑制了麻疹病毒噬斑的形成。

李大金等对分子佐剂C32d3的研究表明C32d3与hCG β基因融合后能显著增强hCGβ基因避孕疫苗的免疫原性、体液免疫应答及抗体类型转换。

Dempsey等将鸡卵溶菌酶(HEL)与小鼠C3d分子串联在一起,以此免疫小鼠。

结果显示,C3d分子偶连的HEL的免疫原性比单纯HEL增强1 000倍,大大降低了B细胞激活的活化阈,而且明显强于弗氏佐剂。

3问题和展望
免疫佐剂是研究其免疫佐剂性与毒性的最佳平衡。

也就是说，免疫佐剂是生物反应调节剂中的免疫调节剂,非特异性免疫刺激作用是使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件,但如果这种作用过度或过强，则必然呈现毒副作用。

另外，免疫佐剂要很好地付诸应用，必须进行药代动力学及生理生化等全方位研究。

因此，疫苗佐剂的研究强调多元化。

譬如：诱导黏膜免疫的口服佐剂的研究，因为口服免疫是一种简单易接受的产生全身性免疫的方式，并且黏膜免疫在保护肠道和呼吸道黏膜表面的疾病方面有很重要的作用; 纳米佐剂的研究,纳米佐剂可以避免传统疫苗的载体效应发生，还可提高生物利用度，提高制剂的均匀性、分散性和吸收性，具有较理想的免疫增强作用; 天然佐剂的研究如中草药佐剂的研究，中草药毒副作用小，价格低廉，取材广泛。

多糖类佐剂的研究，多糖类物质是一类十分重要的生物活性物质，具有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素、抗体水平的功能。

多糖经化学修饰形成多孔微颗粒，具有浓缩和贮存抗原的作用。

可见，佐剂的发展趋向于低毒、高效，佐剂的研究价值不仅在于最终的实际应用，而且在于此过程中揭示免疫系统的机理。

主要参考文献
[1] 周慧，盛贤,平文祥.佐剂的研究进展.生物技术,2004，14（4）
[2] Cox JC,Coulter AR.Adjuvants aclassification and review of their modes ofaction .V accine, 1997, 15 (3) : 248-256
[3] 肖琅，孙铭，林芳，2.3 纳米粒子佐剂
[4] Myc A, Kukowska - Latallo JF,Bielinska AU, et al.Development of immuneresponse that protects mice from viralpneumonitis after a single intranasalimmunization with influenza A virus andnanoemulsion . Vaccine,2003, 21 (25 ～26):3801～3814
[5] Stieneker F, Kreuter J, Lower J. Highantibody titers in mice with polymethylmethacry late nanoparticles asadjuvantfor HIV vaccines. AIDS, 1991, 5(4):431～435
[6] 何萍,吕凤林,陈月，等.合成纳米铝佐剂及其对乙型肝炎、狂犬病毒辅佐效应的研究.免疫学杂志,2006，22（1）
[7] 钟石根，冯振卿，仇镇宁，等.钙纳米颗粒作为血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究.中国血吸虫病防治杂志,2001,13(6)
[8] 柴家前,王玲,庞昕，等.沈志强纳米蜂胶颗粒对鸡免疫功能的影响. 畜牧兽医学报2002,33(4)：412～416
[9]肖建雄，罗满林，复合佐剂的研究进展（A），广东畜牧兽医科技.2013.38.I
[10] 曹国文,陈春林,戴荣国,等.中药免疫增强剂抗鸡传染性法氏囊病毒感染试验[J].中兽医医药杂志,2007,26（6）:39-40.
[11] 陈德坤,李俊生,党岩,等.中药佐剂对提高新城疫Ⅱ系疫苗免疫效果试验[J].中国兽医科技,1998,28(11):23-24.
[12] 施建东,胡凝珠,赵蕊蕊,等.氢氧化锌与低分子量透明质酸复合佐剂对甲肝乙肝联合抗原的体液免疫增强作用[J].中国生物制品学杂志,2012,25(1):29-31,35.
[13] 吕殿红,王刚.复方免疫增强剂对鸡新城疫和传染性腔上囊病疫苗免疫效果的影响[J].中国兽医科技,2000,30(10):21-22.
[14] 南京农业大学.用于禽流感灭活抗原的鼻腔免疫复合佐剂[P].中国:200710024385.5,2007-12-12.。