量子点免疫荧光技术在病理诊断中的初步应用

第 20 卷第 2 期 2011 年 4 月
中 国组织化学与细胞化学杂志
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
Vo l 20 N o 2 A pril 2011
量子点免疫荧光技术在病理诊断中的初步应用
朱小波1, 3 黄燕华3
3
彭
俊1, 3
的共表达采用紫外和蓝光激发, 荧光显微镜下直接 观察成像; 而 H er 2 和 CK 蛋白的共表达则在紫外 激发下利用多光谱显微成像系统进行处理。 结 果
荧光显微镜下蓝光激发观察到 p53 蛋白定位于 肺癌细胞的胞核( 图 1a) , L CA 定位于正常阑尾组织 里淋巴细胞的胞膜 ( 图 1b) , Calpo nin 则定位于乳腺 肌上皮细胞的胞质 ( 图 1c) 。以 上 3 种不同蛋白的 定位与免 疫组化 P V 9000 法检测 的完全一 致 ( 图 2a c) , 但量子点免疫荧光的信号更强。 量子点免疫荧光双标法检测到宫颈上皮内瘤变 组织内 CK 和 PCNA 蛋白的共表达 , 荧光显微镜下 紫外和蓝光激发均显示 CK 定位于胞质, 呈红色信 号 , 而 PCNA 定位于胞核, 呈绿色信号 , 定位准确, 背景清晰 ( 图 3a b) 。 H er 2 主要定位于胞膜而 CK 定位于胞质 , 二者定位很接近, 不可避免会有信号的 重叠, 图 3c 显示乳腺癌组织内 H er 2 和 CK 蛋白共 表达的 RGB 原始图像。当两种以上的蛋白定位完 全相同或相近时, 能借助多光谱成像系统进行解混, 会得到每一种蛋白的单独信号, 还可去除组织的自 发荧光 , 可提高图像的信噪比。图 3d 显示多光谱解 混后 H er 2 蛋白表达的信号, 图 3e 显示多光谱解混 后 CK 蛋白表达的信号。图 3f 显示多光谱解混后 H er 2 和 CK 蛋白共表达的信 号, 96. 8% 的肿瘤细 胞呈现共定位, 与图 3c 相比, 去除了组织的自发荧 光 , 显著提高了图像的信噪比, 并且可得到两种蛋白 共定位的准确数值。 讨 论
Initialapplication of quantum dots immunofluorescence technology in pathological diagnosis
Zhu Xiaobo 1, 3 , H uang Yanhua3 , P eng Jun1, 3 , Gao Jun3 , L i Beiy un 3 , Chen H onglei2* ( 1 W uhan T umor N anomet er Di agnosi s E ngi neeri ng Resear ch Center ; 2 Dep ar tment. of Pathology , Basi c Med ical S chool of W uhan Uni ver si ty , W uhan; 3 Wuhan J iay uan Quant um dots Co. , L T D, Wuhan 430072, Chi na) Abstract Object ive Quant um dot s ( QDs) immunof luor escence w as com pared w ith the im mu noenzym e method in uccurat ely locat ing dif f erent pro teins in paraf fin embedded t issues, to det ect co ex pression o f t w o dif f erent prot eins. T he init ial application value o f QDS w as invest igat ed by using it. Met h o ds QDs imm unof luorescence histo chem ist ry ( QDs IH C) and im munoenzym e hist ochemistr y were used t o det ect t he expressio n of p53 pr ot ein in t he lung cancer t issues, calponin prot ein in t he m yoepit helial cel ls of breast tissues, and L CA prot ein in t he normal appendix t issues. Co ex pr ession o f CK and P CNA prot eins in the human cerv ical intraepit helial neoplasia, H er 2 and CK prot eins in t he breast cancer tissues w ere simult aneously det ect ed by QDs double labeling im muno fluorescence. Result s L ocat ion of p53, L CA and calponin prot eins w as complet ely conco rdant t hrough QDs IH C and immunoenzy me hist ochemist ry . Co ex pression of CK and PCNA pro teins in t he cervical intr aepit helial neoplasia, H er 2 and CK prot eins in the breast cancer t issues w ere sim ult aneousl y o bserv ed by QDs do uble labeling imm unof luo rescence com bined w it h m ult ispect ral im ag ing . Conclusion T he same application value w as fo und bet w een QDs IH C and im m unoenzyme hist ochemist ry . Co location of diff erent prot eins were simultaneously detected by QDs double labeling immunofluorescence. Key words Quant um Dot s; Imm unof luo rescence; M ult iple label ing; M ult ispect ral im ag ing 量子点( Quantum dot s, QDs) 或半导体纳米微 晶体 , 作为一种新型的荧光染料用于生物医学领域 的研究始于 20 世纪 70 年代末。与传统荧光染料相 比, QDs 具 有许多独 特的性质 如激发光 谱宽而 连 续、 荧光强度高 , 发光时间长, 光化学稳定性好等特
收稿日期 2010 07 10 修回日期 2011 03 01
基金项目 国家自然科学基金资助 ( 30900652) 作者简介 朱小波 , 男 ( 1972 年 ) , 汉族 , 工程师。 * 通讯作者 ( T o who m co rr espondence sho uld be addr essed)
第2期
朱小波等
量子点免疫荧光技术在病理诊断中的初步应用
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材料和方法 1. 材料 1. 1 组织标本 随机选取我院归档的病理石蜡 标本包括肺癌、 乳腺癌和宫颈上皮内瘤变组织以及 正常阑尾组织各 5 例。 1. 2 主要试剂和仪器 鼠抗人 p53、 CK 、 Calpo nin、 L CA( CD45) 单克隆抗体 ( 浓缩型 , 工作 浓度均 为 1: 150) 、 兔抗人 H er 2 、 PCNA 多克隆抗体 ( 浓缩 型, 工作浓度分别为 1: 150, 1: 200) 、 生物素 化羊抗 鼠和羊抗兔 Ig G( 浓缩型, 工作浓度 1: 400) ; 免疫组 化 PV 9000 通用型试剂盒( 即用型 ) ; 量子点超敏试 剂盒 ( 605nm QDs SA ) 、 量 子 点 双染 荧 光 试 剂 盒 ( 605nm QDs SA 和 545nm QDs IgG( 羊抗兔) ) ; 荧 光图像采集和分析 采用日本 Olym pus BX51( CCD DP72) 和美国剑桥 NuanceT M 多光谱显微成像系统 ; 以上试剂和仪器均由武汉珈源量子点技术开发有限 公司提供。 2. 方法 2. 1 量子点免疫荧光组织化学法检测不同蛋白 的定位 [ 2] 实验方法参照文献 , 采用 605nm 发射波长的 量子点标记的链霉亲和素为基础检测不同组织中蛋 白的定位。如正常阑尾组织 L CA 、 乳腺肌上皮组织 Calponin、 肺癌组织 p53 蛋白的定位。上荧光显微 镜蓝光激发, 605nm QDs SA 以细胞内出现红色的 荧光信号为阳性。用 T BS 代替一抗作阴性对照, 以 已知阳性片作阳性对照。 2. 2 免疫组化 PV 9000 法检测不同蛋白的定位 为了验证量子点免疫荧光法检测不同蛋白的定 位是否准确, 在连续切片上也分别检测了正常阑尾 组织 L CA 、 乳腺肌上皮组织 Calponin 、 肺癌组织 p53 蛋白的表达。详细实验步骤, 严格按照说明书进行。 采用 DAB 显色 , 苏 木精复 染, 封片 后 在 Olym pus BX51( CCD DP72) 成像系统进行与量子点免疫荧光 法相同视野成像分析。 2. 3 量子点免疫荧光双标法检测两种蛋白的共 表达 [ 3] 详细实验步骤参照文献 , 简述如下 : 在宫颈上 皮内瘤变组织内检测 CK 和 P CN A 蛋白的共表达 , 乳腺癌组织内检测 H er 2 和 CK 的共表达。分别滴 加用抗体 稀释液稀释的 QDs SA ( 605nm ) 和 QDs Ig G( 545nm ) , 37 ! 湿 盒孵 育 45 min; T BS 洗 ( 2 ∀ 3min) , 90% 缓冲 甘油 封片 , 荧 光显微 镜下 观察 成 像, QDs IgG( 545nm) 标记的 H er 2 蛋白以细 胞胞 膜内出现绿色的荧光信号为阳性, 而 PCNA 则定位 于胞核; QDs SA( 605nm) 标记的 CK 蛋白以细胞质 内出现红色的荧光信号为阳性。CK 和 PCNA 蛋白
高
2
俊3
Fra Baidu bibliotek
李蓓芸3
陈洪雷2*
( 1 武汉市肿瘤纳米诊断工程技术研究中心 ;
武汉大学基础医学院病理学教研室 ;
武汉珈源量子点技术开发有限公司 , 武汉 430072)
摘要 目的 利用量子点 ( quantum do ts, Q Ds) 免疫荧光技术检测石蜡包埋组织中 不同蛋白的定位与免疫酶法进行 比 较 , 以及两种蛋白的共表达 , 并探讨其初步应用价值。方法 利用 Q Ds 免疫荧光和免疫酶组织化学方法分别 检测正常阑尾 组 织 L CA 、 乳腺肌上皮组织 Calponin 、 肺癌组织 p53 蛋白 的表达 , 并利用 Q Ds 免疫 荧光双标 法同时检测 了宫颈上 皮内瘤变组 织 内 CK 和 PCN A 蛋白、 乳腺癌组织 内 Her 2 和 CK 蛋 白的 共表 达。结果 Q Ds 免 疫 荧光 和免 疫 酶组 织化 学 技术 分别 检 测 LCA 、 Calpo nin 和 p53 蛋 白的定位完全一致。 QD s 免疫荧光双标法结合多光谱成像可同时观察 到宫颈上皮 内瘤变组 织内 CK 和 PCN A 蛋白、 乳腺癌组织内 Her 2 和 CK 蛋白的共表达 。结论 Q Ds 免疫 荧光组 织化学 法具有与 免疫酶 法等同 的应用 价 值。 QDs 免疫 荧光双标法可同时检测不同蛋白的共定位。 关键词 量子点 ; 免疫荧光 ; 多重标记 ; 多光谱成像 中图分类号 R392 3 文献标识码 A DOI : 10 3870/ zg zzhx 2011 02 003
性 , 还能够对亚细胞分子进行多种标记, 使之成为近 乎完美的荧光标志 物, 故量子 点点亮了病理 学[ 1] 。 本研 究 利 用 不 同 发 射 波 长 的 量 子 点 ( 605nm, 545nm) 标记的生物分子如链霉亲和素、 二抗 IgG 为 基础 , 采用量子点免疫荧光组织化学方法 ( QDs im munofluorescence hist ochem ist ry, QDs IH C) 在石 蜡包埋的不同组织切片上检测不同蛋白的定位以及 两种蛋白的共表达 , 并与传统的免疫酶法进行比较, 评价其初步应用价值。