抗生素对小鼠菌群失调腹泻肠道菌群多样性的影响_郭抗萧_尹抗抗_王欢_等

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中国微生态学杂志 2014 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chinese Journal of Microecology，Mar． 2014，Vol． 26 No． 3
素使肠道正常菌群失调，生理性细菌大量减少，而 条件致病菌大量繁殖； 使多糖发酵成短链脂肪酸减 少，未经发酵的多糖不易被吸收，滞留于肠道而引 起渗透性腹泻； 抗生素的直接作用可引起肠黏膜损 害、肠上皮纤毛萎缩及细胞内酶的活性降低，或者与 肠道内胆汁结合使脂肪吸收减少，从而导致吸收障 碍性腹泻。菌群失调是指由于受某些因素的影响， 正常菌群中各种细菌的种类和数量发生的变化。严 重的菌群失调使机体出现一系列临床症状，这主要 见于长期应用广谱抗生素治疗的患者，其体内对抗 生素敏感的细菌被大量杀灭，而不敏感的细菌，如 金葡菌、白色念珠菌等则乘机繁殖， 引起假膜性肠 炎、白色念珠菌性肺炎等，这些疾病临床上也称二重 感染［2］。二重感染使对诊断有参考作用的症状和体 征被掩盖，给诊断带来困难，因延误诊断而错过最 佳的治疗时机，给疾病的防治带来很大的麻烦，产 生严重的不良后果［3］。为探讨抗生素造模对肠道菌 群多样性的影响，课题组采用分子生物学的方法对 实验小鼠肠道菌群的多样性进行研究，现报道如下。
Corresponding author： TAN Da-quan，Email： guokangxiao123@ aliyun． com； TAN Zhou-jin，Email： tanzhjin@ sohu． com
Abstract： Objective To probe the effect of antibiotics on intestinal microbiotia and provide scientific evidence for the clinical effect of medicine． Methods Diarrheal mice model was constructed via administration of antibiotics． Intestinal microbial metagenomics DNA was extracted and PCＲ amplification was done by using specific primers ． The diversity of PCＲ product was analysised by using amplified rDNA restriction analysis（ AＲDＲA） ． Ｒesults The OTUs number of bacteria of normal group and model group was 6 and 5 respectively． The OTUs of lactobacillus of normal group and model group was 6 and 4 respectively． The diversity of bacteria and lactobacillus of model group was 59． 91% and 40． 00% compared with normal group respectively． Conclusion Antibiotics model made the destruction of intestinal microecology． And gut flora diversity declined． Key words： Antibiotics； Intestinal microorganisms； Diversity； Amplified rDNA restriction analysis
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
抗生素于 20 世纪 40 年代首次现身时，被人们 惊呼为“神药”，是现代医学的奇迹。情况也确实如 此， 曾 经， 每 年 夺 取 数 百 万 人 生 命 的 感 染 性 疾 病， 因为抗生素而得以治愈。人类的健康状况得到了极 大的好转，期望寿命得到了显著的提高［1］。随着医 学技术日新月异的发展，但随着抗生素的广泛使用， 其常见的副反应中抗生素相关性腹泻 （ antibiotic-associated diarrhea，AAD） 受到越来越多的重视。抗生
基金项目： 国家自然科学基金（ 81173214） ； 湖南省教育厅重 点项目（ 13A068）
作者简介： 郭抗萧（ 1988-） ，女，硕士生，从事中医药微生态 学研究，Email： guokangxiao123@ aliyun． com
通讯作者： 谭达全（ 1954-） ，男，教授，博士生导师，从事中 医基础理论研究，Email： guokangxiao123 @ aliyun． com； 谭周进（ 1969-） ，男，教授，博士，博士生导 师，从事中医药微生态学研究，Email： tanzhjin@ sohu． com
中国微生态学杂志 2014 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chinese Journal of Microecology，Mar． 2014，Vol． 26 No． 3
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·论 著·
抗生素对小鼠菌群 失调腹泻肠道菌群多样性的影响
郭抗萧1 ，尹抗抗1 ，王欢1 ，郭纯2 ，赵先平1 ，曹蓉1 ，谭达全1 ，谭周进1 1． 湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；
剂均为国产分析纯。0． 1 mol / L PBS （ pH 7． 4） 、Tris 缓 冲 液、0． 5 mol / L EDTA、TE 缓 冲 液、10 mg / mL ＲnaseA、10% SDS、3 mol / L 乙酸钠、24 ︰ 1 的氯仿异 戊醇 （ v / v ） 、70% 乙 醇、10 × TBE 缓 冲 液、10 × Taq Buffer、1% 琼脂糖凝胶，均参照文献［5，6］配制。 1． 2 方法 1． 2． 1 动物分组 12 只 KM 小鼠适应性饲养 3 d 后 随机分成 2 组，即正常组、模型组。 1． 2． 2 造模方法 参照文献［7］，正常组给予无菌 生理盐水 0． 35 mL / （ 只·次） 灌胃，模型组采用抗生 素混合液 0． 35 mL / （ 只·次） 灌胃。每天 2 次，连续 5 d，粪便稀湿即可。 1． 2． 3 小鼠肠道内容物的提取 造模成功后，将小 鼠短颈处死后，立即放于超净工作台上，无菌采集 各组回肠段内容物，同组每 2 只小鼠的肠道内容物 收集在一起，将样品至于冰上，并立即带回实验室， － 20 ℃ 保存备用。 1． 2． 4 样品预处理 取一定量的小鼠肠道内容物于 无菌离心管中，具体处理方法参照文献［5］，备用。 1． 2． 5 肠道菌群宏基因组的提取 肠道微生物宏基 因组提取参照文献［5，6］进行， － 20 ℃ 保存备用。 1． 2． 6 宏基因组特异性引物 PCＲ 扩增 PCＲ 反应 体系： 10 × PCＲ Buffer 5 μL， dNTP 4 μL， 引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL，Taq 酶（ 2． 5 U / μL） 1 μL，无 菌水补 足 50 μL。 PCＲ 扩 增 条 件： 94 ℃ 预 变 性 5 min； 94 ℃ 变性 45 s、52 ℃ 退火 45 s、72 ℃ 延伸 90 s，36 个循环； 最后 72 ℃ 延伸 10 min。PCＲ 产物用 0． 7% 琼脂糖凝胶电泳检测观察分析后，保存于 4 ℃ 冰箱中，待用。 1． 2． 7 对 PCＲ 产物进行胶回收 按照高效离心柱 型琼脂糖凝胶回收试剂盒“NEP025-1”说明书进行。 1． 2． 8 扩增核糖体限制性酶切片断分析 以 Hha I、 Ｒsa I、Sam I 和 Hind III 酶切 PCＲ 产物， 反应体系 为： PCＲ 产 物 10 μL， ddH2 O 12 μL， 10 × buffer 2 μL，Hha I、Ｒsa I、Sam I 和 Hind III 酶 各 2 μL。 37 ℃ 反应 4 h 后经 1% 琼脂糖凝胶电泳、EB 染色、凝 胶成像仪观察分析。 1． 2． 9 多态性分析 AＲDＲA 带型视为一个 OTU， 用 Quantity One 软件将琼脂糖凝胶上出现的 DNA 片 段转化成分子量信息，按“出现”记为 1，“不出现” 记为 0，进行统计。模糊条带及分子量小于 100 bp 的条带忽略不计。 1． 2． 10 相似性及多态性指数 相似性采用索伦森 配对相似性系数 （ Sorenson Pairwise Similarity Coefficien，Cs） 计算。Cs = 2j / （ a + b） × 100，其中 S 为索
1 材料与方法
1． 1 材料 1． 1． 1 动物 体重为 （ 20 ± 2 ） g 清洁型昆 明 小 鼠 12 只，雌雄各半，购于湖南斯莱克斯实验动物有限 公司。 1． 1． 2 饲料 由湖南中医药大学动物实验中心 提供。 1． 1． 3 屏蔽环境实验设施 湖南中医药大学动物实 验中心。 1． 1． 4 药物 抗生素混合溶液： 硫酸庆大霉素注射 液（ 2 mL： 8 万单 / 支，批号： 5120106） 、头孢拉定胶 囊（ 0． 25 g / 粒，批号： 110804） ，将硫酸庆大霉素注 射液和 头 孢 拉 定 胶 囊 用 无 菌 生 理 盐 水 配 成 浓 度 为 62． 5 g / L 的抗生素混合液 （ 即 6 支庆大霉素与 3 粒 头孢拉 定 胶 囊 配 制 成 混 合 液） ，4 ℃ 冰 箱 中 保 存 备用。 1． 1． 5 试 剂 细 菌 通 用 引 物 27F （ 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'） 、1492Ｒ （ 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） ； 乳 杆 菌 特 异 性 引 物 7f （ 5'AGAGTTTGAT（ C / T） （ A / C） TGGCTCAG-3'） 、LAB-rev （ 5'-CTCAAAACTAAACAAAGTTTC-3'） ［4］委托北京鼎 国昌盛生物技术有限责任公司合成。溶菌酶、蛋白酶 K、dNTP、Taq 酶、高效离心柱型琼脂糖凝胶回收试剂 盒和限制性内切酶 Sam I、Hind III、Hha I 和 Ｒsa I 均 购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。其他试
中图分类号： Ｒ378 文献标志码： A 文章编号： 1005-376X（ 2014） 03-0249-04 DOI 编码： 10． 13381 / j． cnki． cjm． 201403001
The effect of modeling dysbacterial diarrhea with antibiotics on molecular diversity of intestinal microbiota in mice
GUO Kang-xiao1 ，YIN Kang-kang1 ，WANG Huan1 ，GUO Chun2 ， ZHAO Xian-ping1 ，CAO Ｒong1 ，TAN Da-quan1 ，TAN Zhou-jin1
1． Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China； 2． The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China
2． 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007
摘要： 目的 探讨菌群失调腹泻抗生素造模对小鼠肠道菌群多样性的影响，为临床用药提供依据。方法 运用混合抗生素建立小鼠菌群失调腹泻模型，采集肠道内容物，提取肠道微生物宏基因组，通过特定引 物 PCＲ 扩增后进行扩增核糖体 DNA 限制性分析（ Amplified rDNA Ｒestriction Analysis，AＲDＲA） 探讨其多样 性的变化。结果 正常组和模型组细菌的 OTUs 数为 6、5，乳酸杆菌的 OTUs 数为 6、4； 模型组细菌和乳酸 杆菌的多样性同正常组比较分别为 59． 91% 、40． 00% 。结论 抗生素造模使得肠道内的微生态平衡被破 坏，肠道菌群多样性下降。 关键词： 抗生素； 肠道菌群； 多样性； 扩增核糖体 DNA 限制性分析