第三章动物细胞融合与杂交
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• 2.融合条件（温度、pH值、氧气）
• 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50— 100mmol/L）
2020/9/30
第三节 融合子的检出与鉴定
• 一、融合子的筛选 • 遗传互补筛选法：HAT筛选 • 营养缺陷型互补选择法 • 抗性互补选择法 • 形态特征选择法 • 生长特性选择法
2020/9/30
2020/9/30
使用仙台病毒诱导细胞融合步骤
1. 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心 2. 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬
液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 3. 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使
其进行融合 4. 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性
培养基进行培养。
2020/9/30
二．融合方法 1.病毒诱导融合：
最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、 天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类 融合剂。
灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以 大大提高融合频率。它在病毒类融合剂 中最为有效，使用最广。
2020/9/30
灭活仙台病毒诱导融合的机理
灭活的 病毒既保留 了诱导细胞 融合的能力， 又不会感染 细胞。
2．化学诱导融合
它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙 烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘 油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂 酰胆碱、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和 二价阳离子载体等。其中则以PEG的使 用最为广泛。
2020/9/30
PEG可能的促融合作用机理
1、PEG可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重 排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。 2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂 质体扦入与膜结合。 3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋 白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的 排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。
存活 死亡
• 二、融合子的鉴定 • 1.细胞学鉴定：染色体鉴定 • 2.生化分析：同工酶谱分析 • 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术
2020/9/30
第四节 杂交瘤技术
• 一、基础知识： • 抗体：免疫球蛋白 • 抗原：可诱导机体产生免疫应答，并可与
应答产物结合的外来“异物”。 • 免疫反应：指机体免疫系统对异己物质的
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞/脾细胞 骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出 不能长期存活
不能长期存活
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HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质 融合和核融合形成融合细胞的现象。 • 细胞杂交：不同类型的细胞之间发生的融 合叫做细胞杂交。（种间杂交、种内杂交 ） • 目的：获得杂种优势
2020/9/30
第二节 细胞融合的方法
• 一、细胞融合的一般过程
2020/9/30
细胞融合过程可分为： 凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关 蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提 脂质分子重排：是实现细胞融合的关键 20胞20/9/质30 合并：后续的稳定步骤。
识别与清除等一系列复杂过程。 • 抗体分子组成：2 Fab + 1 Fc • 单抗：单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的
子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的 抗体。（均一性、特异性）
• PEG的处理时间。悬浮法，1－2分钟
•
离心法，5－8分钟
2020/9/30
若辅以5－15％的二甲亚砜或在融合前先 用植物血凝素处理一下，则效果更好。
PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操 作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。 使目前最常用的细胞融合诱导方法。
2020/9/30
3．电融合法：
H
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单wk.baidu.com酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
T
外源性途径(旁路途径)
胸腺嘧啶激酶 ( TK )
(Thymidine kinase)
DNA
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B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
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电融合技术的优点
①对细胞损伤小。 ②融合效率高。 ③融合方法快速，可重复性强。 ④融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪 、鉴定，可控性好。
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电融合技术的不利之处：
• 最大的不利之处是仪器的购置。 • 在融合大小不同的细胞时存在问题。 • 在融合膜成分不同的细胞时存在困难。
电融合技术的原理： 悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中 的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的 交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子 ，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度 和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的 接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。
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电融合技术的改进方法
• 1、物理法 磁-电融合法 声-电融合法 电-机融合法
• 2、化学法 利用化学试剂（刀豆蛋白A等）凝集细胞
后电融合。 • 3、特异性电融合法
利用抗原抗体特异性结合凝集细胞电击 。
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三、细胞融合的影响因素
• 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面 性质、亲本细胞的亲缘关系）
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PEG诱导细胞融合的效果：
• PEG分子量大小:1000－6000
• 浓度:30－60％。
• PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它 的细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为PEC 浓度为30－50％时，以分子量1000的融合效 果最佳。如果浓度增至50％和60％时则改变 PEG400为好。
第三章 动物细胞融合与杂交
概念：细胞融合，HAT培养基，有限稀释法，单 抗
掌握：1、细胞融合的方法和原理 2、B淋•巴一细、胞细杂胞交融瘤合技和术杂的交原概理述和过程 • 二、细胞融合方法 • 三、融合子的检出与鉴定 • 四、杂交瘤技术
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第一节 细胞融合与杂交概述
• 一.概念和目的 • 细胞融合：自然或人为条件下，两个或两
• 3.离子强度和种类（一般是Ca2+，50— 100mmol/L）
2020/9/30
第三节 融合子的检出与鉴定
• 一、融合子的筛选 • 遗传互补筛选法：HAT筛选 • 营养缺陷型互补选择法 • 抗性互补选择法 • 形态特征选择法 • 生长特性选择法
2020/9/30
2020/9/30
使用仙台病毒诱导细胞融合步骤
1. 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心 2. 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬
液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集 3. 温度升至37℃ ，间歇摇动30分钟，使
其进行融合 4. 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性
培养基进行培养。
2020/9/30
二．融合方法 1.病毒诱导融合：
最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、 天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类 融合剂。
灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以 大大提高融合频率。它在病毒类融合剂 中最为有效，使用最广。
2020/9/30
灭活仙台病毒诱导融合的机理
灭活的 病毒既保留 了诱导细胞 融合的能力， 又不会感染 细胞。
2．化学诱导融合
它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙 烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇、聚甘 油、溶血卵磷酯、磷脂酰丝氨酸、磷脂 酰胆碱、甘油－醋酸酯、油酸、油胺和 二价阳离子载体等。其中则以PEG的使 用最为广泛。
2020/9/30
PEG可能的促融合作用机理
1、PEG可能使细胞膜的脂类分子的物理结构发生重 排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。 2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂 质体扦入与膜结合。 3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋 白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的 排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。
存活 死亡
• 二、融合子的鉴定 • 1.细胞学鉴定：染色体鉴定 • 2.生化分析：同工酶谱分析 • 3.分子生物学鉴定：DNA探针技术
2020/9/30
第四节 杂交瘤技术
• 一、基础知识： • 抗体：免疫球蛋白 • 抗原：可诱导机体产生免疫应答，并可与
应答产物结合的外来“异物”。 • 免疫反应：指机体免疫系统对异己物质的
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞/脾细胞 骨髓瘤细胞/ 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
筛选出 不能长期存活
不能长期存活
2020/9/30
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)
个以上细胞相互接触，发生膜融合、胞质 融合和核融合形成融合细胞的现象。 • 细胞杂交：不同类型的细胞之间发生的融 合叫做细胞杂交。（种间杂交、种内杂交 ） • 目的：获得杂种优势
2020/9/30
第二节 细胞融合的方法
• 一、细胞融合的一般过程
2020/9/30
细胞融合过程可分为： 凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关 蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提 脂质分子重排：是实现细胞融合的关键 20胞20/9/质30 合并：后续的稳定步骤。
识别与清除等一系列复杂过程。 • 抗体分子组成：2 Fab + 1 Fc • 单抗：单克隆抗体是指由一个B细胞分化增殖的
子代细胞(浆细胞)产生的针对单一抗原决定簇的 抗体。（均一性、特异性）
• PEG的处理时间。悬浮法，1－2分钟
•
离心法，5－8分钟
2020/9/30
若辅以5－15％的二甲亚砜或在融合前先 用植物血凝素处理一下，则效果更好。
PEG诱导融合的优点：PEG来源广泛，操 作简单，诱导率也相对于病毒诱导要高。 使目前最常用的细胞融合诱导方法。
2020/9/30
3．电融合法：
H
次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )
外源性途径(旁路途径)
谷氨酰胺 or 单wk.baidu.com酸尿苷酸
二氢叶酸还原酶
A
内源性途径(主要途径)
T
外源性途径(旁路途径)
胸腺嘧啶激酶 ( TK )
(Thymidine kinase)
DNA
2020/9/30
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
2020/9/30
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电融合技术的优点
①对细胞损伤小。 ②融合效率高。 ③融合方法快速，可重复性强。 ④融合细胞可在光镜下直接观察、跟踪 、鉴定，可控性好。
2020/9/30
电融合技术的不利之处：
• 最大的不利之处是仪器的购置。 • 在融合大小不同的细胞时存在问题。 • 在融合膜成分不同的细胞时存在困难。
电融合技术的原理： 悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中 的细胞，在1－100MHz和100－1000V/cm 的 交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子 ，而沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度 和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的 接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。
2020/9/30
2020/9/30
电融合技术的改进方法
• 1、物理法 磁-电融合法 声-电融合法 电-机融合法
• 2、化学法 利用化学试剂（刀豆蛋白A等）凝集细胞
后电融合。 • 3、特异性电融合法
利用抗原抗体特异性结合凝集细胞电击 。
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三、细胞融合的影响因素
• 1.细胞种类和性质（细胞种类、细胞的表面 性质、亲本细胞的亲缘关系）
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PEG诱导细胞融合的效果：
• PEG分子量大小:1000－6000
• 浓度:30－60％。
• PEG分子量和浓度越大，其融合率越高，但它 的细胞毒性和粘度也随之增大。一般认为PEC 浓度为30－50％时，以分子量1000的融合效 果最佳。如果浓度增至50％和60％时则改变 PEG400为好。
第三章 动物细胞融合与杂交
概念：细胞融合，HAT培养基，有限稀释法，单 抗
掌握：1、细胞融合的方法和原理 2、B淋•巴一细、胞细杂胞交融瘤合技和术杂的交原概理述和过程 • 二、细胞融合方法 • 三、融合子的检出与鉴定 • 四、杂交瘤技术
2020/9/30
第一节 细胞融合与杂交概述
• 一.概念和目的 • 细胞融合：自然或人为条件下，两个或两