高效液相色谱

高效液相色谱仪简介

系别：应用化学系

专业班级：应用化工技术0921

姓名：曹晋波

指导教师：***

运城学院

2012年 5 月

高效液相色谱仪

摘要：高效液相色谱仪高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

关键词：流动相，色谱柱(固定相)，吸附，解吸

1 前言

高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）也叫高压液相色谱（high pressure liquid chromatography）、高速液相色谱（high speed liquid chromatography）、高分离度液相色谱（high resolution liquid chromatography）等。液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种,但通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论,在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化,这种色谱技术被称为高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。

1．1 高效液相色谱发展

1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手

段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。

高效液相色谱原理

高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固

定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时,

经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形

式打印出来。

2 仪器简介

2.1 仪器组成

高效液相色谱仪高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。

2.2 常见操作系统

2.2.1 （简单）等度系统

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2.2.2 低压梯度系统

123456789 2.2.3 高压梯度系统

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3 操作步骤

1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。主要分为有机滤膜和无机滤膜，尺寸为0.45um

2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟，将流动相内的小气泡赶出，一方影响测样，及对仪器造成损伤。

3. 打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4. 进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先进行清洗。用无离子水直接冲洗吸滤头，后放入流动相中，确保滤头完全浸泡在流动相中，点击purge键进行脱气，待脱气完成后点击pump键。

6. 在进行测样前，需根据不同样对仪器的波长及流速进行设置，及对色谱柱和定量环进行更换。

7. 设计走样方法。点击file，选取se-lect users ａnd methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9. 关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。

10. 填写登记本，由负责人签字。

4 常见问题及解决方法

4.1 HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

1. 样品量不足，解决办法为增加样品量

2. 样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3. 样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4. 检测器衰减太多。调整衰减即可。

5. 检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6. 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7. 检测池中有气泡。解决办法为排气。

8. 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

9. 流动相流量不合适。调整流速即可。

10. 检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。

4.2 HPLC柱柱压过高

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1. 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；

2. 把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3. 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；

4. 更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。