高效液相色谱法的简介

全多孔型固定相：

它由直径为 10nm 的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微 粒凝聚成全多孔型固定相。 特点：颗粒很细（3～10μm），孔仍然较浅，传质速率快， 最大允许进样量比表面多空型固定相大，易实现高效、高 速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析

（二）流动相
由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲 和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选 择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的 要求是： (1) 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂 的纯度 也要求高。 (2) 低粘度。使用高粘度溶剂，会增高压力，不利于 分 离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。 粘度过于低的溶剂易在色谱柱或检测器内形成气 泡，影响分离. 一般溶剂沸点要高于55℃，以便降低 其挥发度
高效液相色谱法
(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
一. 高效液相色谱法的产生和发展
高 效 液 相 色 谱 法 （ high performance liquid
chromatography, HPLC）是20世纪六十年代末在经典
液相色谱法（ LC ）的基础上引入了气相色谱（ GC ）的 理 论 和 技 术 ，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度 检测器发展而成的分离分析方法。

Hale Waihona Puke Baidu
阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等
固定相
阳离子交换剂 阴离子交换剂 类型 强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂 强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂 官能团 -SO3-CO2-NR3+ -NH2+
按固定相制作方法可分为： 1多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)； 2表面多孔型(包括薄膜型)离子交换树脂； 3离子交换键合型。


离子交换色谱
离子色谱
排阻色谱
亲和色谱
高效液相色谱固定相和流动相 （－）固定相
1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两 大类：
刚性固体：以二氧化硅为基质，可承受 7.O×108 ～ 1.O×109Pa 的高压，可 制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官 能团，就是键合固定相。 硬胶：主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基 交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。
1.1 HPLC与经典LC区别

主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低 分析周期长 无法在线检测 2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）
高压输送流动相 柱效高 分析时间大大缩短
高效液相色谱分离方法的选择参考表
五.高效液相色谱仪
高效液相色谱仪
色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统、进样系统、分离 系统、检测系统、信号放大记录系统组成，其中高压泵、色 谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件。 1．贮液罐 （滤棒，可滤去颗粒状物 质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集 器 7．记录装置
固定相极性大 正相键合色谱法 流动相极性小 分析对象 硅胶-OH(或双-OH)，硅胶-CN 烃类+适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离 异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。
反相高效液相色谱

反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料作固定相、 以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。如 在硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相，以极性强 的水、甲醇、乙腈作流动相的高效液相色谱。

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离 子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离 子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H +
时间，min
硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响
1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯
可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。
正、反相色谱中极性和保留时间的关系
正相色谱中，极性弱的物质先被洗出。 反相色谱中，极性强的物质先被洗出。
3.3 离子交换色谱


化学键合固定相 ：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 C-18柱（反相 柱）。
正相高效液相色谱

正相高效液相色谱是指以亲水性的填料作固定相 (如在 硅胶上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相 )，以疏水 性溶剂或混合物作流动相(如己烷)的液相色谱。在液相 色谱发展的早期，类似于气相色谱把含羟基、氨基或 氰基的极性固定相涂渍在硅胶上这样容易被流动相冲 洗掉，现在几乎都使用键合固定相了。

相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
2.流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了 因素，对分离起很大作用,流动相种类较多，选择余地广,流动相极性和 pH值的选择也对分离起到重要作用,选用不同比例的两种或两种以上液 体作为流动相 ,可以增大分离选择性.
2. 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全 多孔型固定相两类
表面多孔型固定相：
它的基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多 孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子 筛、聚酰胺等。 特点：多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰 迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易 ，梯度淋洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。 由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。

(3) 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的
溶剂。也要避免流动相与固定相发生作用而使柱效下 降或损坏柱子。如使固定液溶解流失。

(4) 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好 的选择性。
(5) 溶剂要与检测器匹配。 对于紫外吸收检测器，流动相不应有紫外吸收。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较 大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。
3.5 亲和色谱

原理 ：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离
先在载体表面键合上一种具有一 般反应性能的所谓间隔臂(环氧、 配基将只能和具有亲和力特性吸 附的生物大分子作用而被保留。 改变淋洗液后洗脱。
高效液相色谱法分类和正反相色谱体系
上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离， 也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。

的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异 丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液 –液分配色 谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 3．根据分子结构选择

用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么 官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、 碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液 – 液分配色谱、液–固吸附色谱；异构体用液–固吸附 色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液 – 液分配 色谱
固定相极性小 如硅胶-C18，硅胶-苯基； 流动相极性大 甲醇-水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法 分析对象 多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流 动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离 解的化合物，如有机有机酸、有机碱和酚类。
固定相：C1
固定相：C8
固定相：C18
四.分离类型的选择

1．据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气 相色谱。标准液相色谱类型（液 –固、液–液、及离子 交换色谱）最适合的相对分子质量范围是 200 ～ 2000 。 对于相对分子质量大于 2000 的样品，则用尺寸排阻法 为最佳。

2．根据溶解度选择 清楚样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的 溶解度是很有用的。如果样品可溶于水属则属于能离 解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃 类（如苯或异辛烷），则可采用液–固吸附色谱；如样 品溶解于四氯化碳，则多采用常规
流动相

离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定pH和离子 强度) ，通过改变 pH 、缓冲剂类型、离子强度、加入 有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂 的选择性，进而影响样品待测物的分离。
3.3 离子对色谱
分离原理：
离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相 反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相 中，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对，从而控 制溶质离子保留行为的一种色谱法；
离子对色谱机理：离子对形成机理；离子交换机理；离 子相互作用机理；
例如离子对形成机理：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，组分离子 A-，加入一种反荷离子B+，B+离子由于静电引力与带负电的组分离子生成 离子对化合物A-B+。
A
水相
B
有机相
A B


有机相
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而被非极性固定相（有机 相）提取。 组分离子的性质不同，与反离子形成离子对的能力大小不同以及 形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同； 离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。
可以在线检测
1.2 HPLC与GC差别
1．分析对象
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及
高聚物的样品不可检测 ,占有机物的20%.
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性 和热稳定性的限制,分子量大、难气化、热稳 定性差及高分子和离子型样品均可检测.用途广范， 占有机物的80%。
3.2 液-液分配色谱


固定相与流动相均为液体（互不相溶）；
基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相 ：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即 流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱），反之， 流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱）。正相 与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采 用；
材料 葡萄糖凝胶 聚苯乙烯 聚苯乙烯 聚乙酸酯 玻璃珠 多孔硅胶
型号 Sephadax Bio-head-S Styragel Emgel(OR) CPG-10 Porasil
特点 溶胀,小分 子分离 溶胀较小 流速较小 刚性大、高 流速分离
流动相 水 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂 有机溶剂和水 有机溶剂和水

3.1 液-固吸附色谱法
固定相为固体吸附剂,流动相为液体。

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常 使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂

分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异，即物质吸附作用的不同来分离的。

适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性
HPLC示意图
5.1高压泵系统
目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压和恒流泵，恒流泵使 输出的液体流量稳定，而恒压泵则使输出的液体压力稳定。恒 流泵中有往复泵、累积型往复泵、注射泵，恒压泵有气动放大 泵。各种高压泵均具有以下性能： (1) 泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢或优质 耐酸不锈钢。 (2) 能在高压下连续上作。通常要求耐压40~50MPa· cm-2，能 在8~24h连续上作，压力平稳。 (3) 输出流量范围宽。一般在0.01~10mL/min。 (4) 输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器，大多数 对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降 低基线噪声并获较好的检测下限，流量控制的精密度应小于1 ％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。
3．操作条件差别
GC：加温操作
HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
二. 高效液相色谱法的特点和应用
“三高” “一快” “一广” 高压 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三.各类高效液相色谱法

液-固吸附色谱 液-液分配色谱
3.4 排阻色谱
原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空 隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部 分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出 峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100~105范围内的化合物 按质量分离。
固定相
类型 软性凝胶 半刚性凝胶 刚性凝胶