河北科技大学仪器分析

现有五肽,在280nm处有吸收峰,中性溶液中朝阴极方向泳动;用FDNB测得与之反应的氨基酸为Pro; carboxy-peptidase进行处理,第一个游离出来的氨基酸为Leu;用胰凝乳蛋白酶处理得到两个片段,分别为两肽和三肽,其中三肽在280nm处有吸收峰;用CNBr处理也得到两个片段,分别为两肽和三肽;用胰蛋白酶处理后游离了一个氨基酸;组成分析结果表明,五肽中不含Arg. 试定该短肽的氨基酸序列.

本人总结：仪器分析及波谱分析总结

仪器分析名词解释有：红移、蓝移、程序升温、梯度淋洗、尺寸排阻色谱（凝胶色谱）、朗伯比尔定律、正向色谱。反向色谱。

蓝移和红移：针对的是具有共轭结构的物质在不同条件下（比如不同的酸性、碱性等条件下）的共轭结构发生改变，从而导致最大吸收波长发生移动，共轭结构越大发生红移，反之发生蓝移。共轭有p-π、n-π、σ-π共轭。含有孤对电子的N、S、O等存在孤对电子易发生p-π共轭。（红移和蓝移为去年考题）

苯胺和盐酸反应成盐后会发生蓝移还是红移为什么？（与去年考题相类似）

苯胺中的N近乎sp2杂化（实际上还是sp3杂化），孤对电子占据的轨道可与苯环共轭（发生p-π共轭），电子云可分散于苯环上，使氮周围的电子云密度减小。

在盐酸存在条件下，苯胺和盐酸生成苯胺的盐酸盐，苯胺上的孤对电子为盐酸和苯酐共用，p-π共轭消失，最大吸收波长变短，向短波长方向移动即发生蓝移。

程序升温：根据不同物质汽化温度不同，温度随时间线性或者非线性的升温，将不同汽化温度的物质分离，从而达到测定含量。

梯度淋洗：根据不同物质极性不同，通过改变流动相的配比来改变流动相的极性，根据相似相溶原理将不同极性的物质分离，从而定量分析。朗伯比尔定律：可以通过计算吸光系数及强度

不饱和度：体现分子内部不饱和键的多少情况。双波长法定量；用于两种混合物的定量。

步骤：

（1）在波长λ1时根据朗伯比尔定律测定纯的物质a和b的吸光系数，得到ελ1a、ελ1b（为常数），为测定计算值

（2）在波长λ2时根据朗伯比尔定律测定纯的物质a和b的吸光系数，得到ελ2a 、ελ2b（为常数），为测定计算值

（3）在波长λ1时根据朗伯比尔定律测定混合物的吸收得到公式Aλ1a+b=ca×L×ελ1a＋cb×L×ελ1b（4）在波长2时根据朗伯

比尔定律测定混合物的吸收得到公式Aλ2a+b=ca×L×ελ2＋cb×L×ελ 2 b Aλ1a+b、Aλ2a+b、ελ1a、ελ1b、ελ2a 、ελ2b、L 为常数，以上两式联立，两个公式，两个未知数，可以解得ca、cb。

原子吸收光谱定量分析方法：

方法一：标准曲线法

步骤：以苯甲醇为例

（1）绘制标准曲线：准确称量4~7份不同质量的苯甲醇，溶解后配置成4~7份稀溶液（因为使用朗伯比尔定律的前提是稀溶液），再在苯甲醇的最大吸收波长λ处分别测定前面配置的稀溶液的吸光度A。以A为纵坐标，被测物质的浓度C为横坐标，绘制A~C标准曲线。

（2）在相同实验条件下测定试样溶液的吸光度AX，再在绘制的标准曲线上查得试样溶液的浓度CX，不过该方法为读取的数据，存在较大的误差。

方法二：标准加入法（去年考题）

（1）取相同体积的试样溶液两份，分别移入容量瓶A、B中。

（2）另取一定量的标准溶液加入B中，之后将两份溶液定容。

（3）在相同条件下，测出A、B两份溶液的吸光度。设A瓶中待测物质浓度为CX，B瓶中的加入的标准物质的浓度为CO（CO通过计算可以得到），A瓶中溶液吸光度为AX，B瓶

中的吸光度为AO，则得到AX=KCX 和AO=K(CX+CO)（其中K=ε×L）两个式子作比AX/Ao=CX/( CX+CO)

解得CX即可得到含量。

色谱分类

气相色谱、液相色谱、高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、凝胶色谱、聚酰胺吸附色谱等为常用方法凝胶色谱的分离原理：分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。即分子量大小不同的化合物，在三维网状结构的空间里（类似于立体结构的筛子）小分子容易进入网状结构内部，大分子在网状结构的表面，在流动相的洗脱（冲洗）作用下，大分子在表面运动，小分子在内部运动，内部阻力大，外部阻力小，流动相先将大分子洗脱出来，先出峰。小分子后洗脱出来，后出峰。从而达到定量分析。

凝胶色谱使用范围：适用于大分子物质和小分子物质的定性，定量分析。比如青霉素内聚合物含量的测定以及血液中的蛋白质和小分子物质糖类等的分离定量。聚酰胺吸附色谱的分离原理：原理：氢键吸附。一般认为系通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。

简述正相色谱和反相色谱分离化合物的异同点。(好像去年考来着）

正相分配色谱：固定相：水、缓冲溶液

流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂

洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之化合物极性越大，越后出柱。

应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。

反相分配色谱：固定相：石蜡油、化学键合固定相

流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂

洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等

色谱定性定量方法：

多组分定性：步骤：

（1）系统适应性试验（通俗讲就是寻找何种极性的混合洗脱剂能够将混合物洗脱分离或者用某种混合液能否将混合物分开）

比如：以ＨＰＬＣ将Ａ、Ｂ的混合物分离定性为例，用某种标准展开剂，在薄层板上进行点样展开，即进行薄层色谱（ＴＬＣ）。看看哪种展开剂能够将Ａ、Ｂ两种物质分开，且有适宜Rf值（比移值）。假设为标准展开剂合适的展开剂，用作洗脱液。则可以进行色谱分离定性。分离前提是相对保留值大于１.