超声波破碎高效液相色谱法定量检测核酸

DOI ：10．3724/SP．J．1096．2011．01442

超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸

董莲华

*

盛灵慧王晶黎朋

（中国计量科学研究院，北京100013）

摘

要

采用超声波破碎结合高效液相色谱技术，建立了定量检测质粒DNA 的方法，测量结果可以溯源至核

苷酸标准物质。采用超声波破碎（功率300W ，频率24kHz ）技术将质粒DNA 破碎成200 500bp 的小片段DNA ，再用蛇毒磷酸二酯酶将其水解为4种核苷酸（dCMP ：3．2min ；dTMP ：4．7min ；dGMP ：5．3min ，dAMP ：6．8min ），将产物通过HPLC 分离后，采用外标法进行定量分析。应用此方法对待测质粒pNK603进行定量分析，测定的4种核苷酸的摩尔百分比（AʒT =0．95，CʒG =0．98）与理论值接近。本方法的测定结果（47．24!g /g ）与实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR ，45．98!g /g ）和PicoGreen 荧光染料法（46．02!g /g ）的测定结果没有显著差异，表明建立的超声波-HPLC 方法可以应用于质粒DNA 的定量分析。关键词

质粒；超声波破碎；高效液相色谱；荧光；聚合酶链式反应

2011-01-04收稿；2011-04-15接受

本文系科技支撑项目（No．2008BAK41B01）和博士科研专项基金（No．ATQDB0908）资助*E-mail ：lianhuadong@gmail．com

1引言

核酸是生物遗传信息的载体，对核酸的定量分析是解析核酸结构和功能的基础。目前定量分析核

酸的方法根据其原理的不同分为两类：一类是直接定量检测核酸，主要是通过应用标记探针的杂交反应进行定量检测；另一类是将待测核酸扩增后，再通过酶免疫法（EIA ）、发光分析、荧光分析等方法定量检测扩增产物，主要是定量聚合酶链式反应（PCR ）技术。在应用上述方法测定核酸含量时，其测量结果的溯源性、可比性还未引起关注。但是，在核酸标准物质制备过程中（如质粒分子标准物质），其核酸测量溯源的重要性就凸显出来。为了解决核酸定量测量的准确、溯源问题，各国都在进行探索。本研究试图通过色谱或质谱技术建立一个可溯源的高准确度的测量方法，即将双链的基因组或质粒核酸水解成单核苷酸，通过同位素稀释质谱法测定水解后的核苷酸的含量，据此计算核酸的浓度；还可根据核酸序列信息及4种核苷酸的摩尔浓度检查核酸水解是否完全。应用这种方法测定的结果可以溯源到核苷酸标准品，从而解决核酸测量的溯源问题。

目前，应用同位素稀释质谱测定寡核苷酸（20mer ）浓度的方法已经比较成熟［1］

，但是对于双链，且长度大于几百个碱基对的核酸片段的定量分析，除了紫外吸收法、定量PCR 和荧光染料法外，由于缺乏

相应的标准品，还没有其它成功的方法可用。长片段核酸无法直接完全酶解，因此，建立一个可以将长片段核酸碎裂为小片段核酸进而可以完全水解的方法，是实现大片段核酸的色谱、质谱及毛细管电泳定量分析的关键。本实验的目的是以质粒DNA 为分析对象，利用超声波破碎技术将其破碎成小片段DNA ，通过优化条件使其破碎后的产物可以进行完全酶解，酶解产物利用高效液相色谱（HPLC ）进行定量分析，以期建立一个溯源链清晰，准确度高的核酸定量测量方法。

2

实验部分

2．1

仪器与试剂

1200液相色谱仪（安捷伦中国有限公司）；酶标仪（M200，TECAN ）、荧光定量PCR 仪（AB7900HT ，美国ABI 公司）；JY92ⅡD 超声波破碎仪（南京新辰公司）。Taqman Universal MasterMix 试剂盒（4304437，美国ABI 公司）；SB-AQ 色谱柱（150mm ˑ4．6mm ，安捷伦中国有限公司）；特异性引物和探针（上海英俊公司合成），其中探针5'端采用荧光标记基团FAM 进行标记，

3'端采用荧光猝灭基团TAMRA 第39卷2011年9月

分析化学（FENXI HUAXUE ）研究简报Chinese Journal of Analytical Chemistry

第9期1442 1446

进行标记。具体序列见表1。乙腈（色谱纯）、蛇毒磷酸二酯酶（SVP ）、4种核苷酸标准品，均购自美国

Sigma 公司。

表1NK603特异性序列和内源基因扩增引物和探针

Table 1Primers and probes for GM （genetic modified ）maize NK603event specific gene and endogenous gene

目标序列Target gene

定性/定量扩增Qualitative /quantitative

amplification 引物/探针名称Primer /probe 引物序列（5'-3'）Sequence （5'-3'）

产物大小

Product （bp ）

zSSIIb

定量PCR 扩增Quantitative PCR

zSSIIb-2F 1-5'CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG C zSSIIb-2R 1-3＇TCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG zSSIIb-P FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA 151［2］NK603

定量PCR 扩增Quantitative PCR

NK603-2F 5'-ATG AAT GAC CTC GAG TAA G （T ）CT TGT TAA -3'NK603-2R 5'-AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CACT -3'NK603-P

FAM-TGGTACCACGCGACAGACTTCCACTC-TAMRA

108［3］2．2实验方法

2．2．1

超声波处理及酶解取2mL 质粒pNK603DNA 进行超声处理，重复7次。处理条件：功率

300W ，频率24kHz ，超声4s ，间歇4s 。工作时间50min 。取超声波处理后的DNA 样品60!L ，加入8!L SVP （5mg /L ）和8!L SVP 缓冲液，37ħ酶解3h ，85ħ酶解20min 。设置3个平行，分别以不加SVP 和不加DNA 样品为酶解样品的对照。同时将未经超声波处理的质粒DNA 直接进行酶解作为超声波处理样品的对照。2．2．2HPLC 分析将酶解后的样品经12000g 离心2min ，取上清液转入液相小瓶，上样进行HPLC 分析。流动相A ：20mmol /L 醋酸铵（pH 3．5）；流动相B ：乙腈。梯度洗脱：0 5min ，100%A ；5 10min ，90%A ；10 20min ：90%A ；20 25min ：100%A 。流速：1mL /mim ，进样量20!L 。检测波长254nm 。2．2．3荧光定量PCR 扩增及定量标准曲线的制作为了与HPLC 方法测定质粒浓度结果进行比较，将相同的质粒DNA 样品进行荧光定量PCR 扩增，测定其浓度。采用表1中的引物和优化的扩增体系

［4］

进行PCR 扩增。扩增条件：95ħ，

5min ；45个循环：95ħ，15s ；60ħ，1min 。标准曲线的制作：将质粒DNA 用荧光染料法测定浓度后，梯度稀释成5个标准溶液，采用上述条件和体系进行扩增，以初始质粒标准溶液浓度的对数为横坐标，以扩增得到的C t 值为纵坐标作图

。

图1

超声波处理质粒pNK603结果（1 7泳道分别为超声处理10min ，

15min ，20min ，marker ，

30min ，50min ，未处理质粒）

Fig．1Electrophoreses result of plasmid pNK603treated byultrasonic （lane 1to 7are ultrasonic treatment for 10min ，15min ，20min ，marker ，

30min ，50min and untreated pNK603）

拷贝数（L ）与质量浓度（C ）换算公式：L =C DNA ˑ6．02ˑ1023/（3301ˑ660）

其中，

C DNA 为质粒浓度（g /L ）；3301为质粒分子的碱基对个数；660为每个碱基对的平均分子量。

2．2．4

荧光染料法测定质粒DNA 浓度采用PicoGreen

试剂盒法对待测质粒DNA 样品进行浓度测定，具体方法见PicoGreen 操作说明书。

3

结果与讨论

3．1

质粒DNA 的超声波破碎

将质粒DNA 进行超声波破碎处理后，采用2．5%琼脂

糖凝胶电泳，结果如图1所示。第7泳道为未经处理的质粒，1 6泳道依次为超声处理10min ，15min ，20min ，marker ，30min 和50min 。由此可见，超声波处理50min 后，质粒pNK603由原来的3．4kbp 破碎成了主带在200 500bp 的DNA 片段。增加超声波处理功率，破碎结果没有

明显差异。另外，通过胶回收测定超声波破碎效率，发现超声波破碎质粒DNA 的最佳浓度为30 90!g /g ；浓度大于200!g /g ，破碎的效率降至50%。

3

441第9期董莲华等：超声波破碎-高效液相色谱法定量检测核酸