纳米金标记分析

第13卷第3期2007年9月

分析测试技术与仪器

ANAL YSIS AND TESTIN G TECHNOLO GY AND INSTRUM EN TS

Volume13Number3

Sep.2007

综述(163～168)

纳米金标记分析

梁月园1,蒋治良1,2,江　波1

(1.广西师范大学环境与资源学院,广西桂林　541004;　2.桂林工学院材料与化学工程系,广西桂林　541004)

摘　要:金纳米粒子是一种性能优异的标记物,在光分析和电分析中应用广泛.综述了它在核酸、蛋白质和生物分子检测中的应用及发展趋势.

关键词:纳米金;金标记;标记分析

中图分类号:O657文献标识码:A文章编号:100623757(2007)0320163206

由于金纳米粒子可以和多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等)结合,易于标记,对人体无害,而且具有标记后被标记物活性基本不发生改变、不同直径的金纳米可以用于多重标记、在检测中样品用量极少、实验结果可以长期保存等特点被应用于生物标记检测.金纳米粒子作为特殊标记物进行生化分析的研究开始于20世纪60年代.1962年Feldherr[1]等开始用金纳米标记细胞进行电子显微镜研究,1971年Taylor[2]又将金纳米粒子引入电镜免疫技术中,开始将金纳米粒子用于免疫标记技术.目前,随着纳米技术的发展,金纳米粒子因其具有制备简单、粒径均匀可控、性质稳定等特点已成为纳米分析化学研究的热点[3～6],并已经发展成为第四大免疫标记新技术.

1　金纳米粒子在核酸检测中的应用

1.1　光学检测

表面等离子体共振(SPR)是一种发生在金属与电介质分界面上的物理光学现象.胶体金在可见区有等离子体共振吸收的特点[7],并且其吸收峰的等离子共振常随着尺寸的变化而发生频移,其溶液的颜色从橘红色到紫红色发生相应的变化,可用肉眼观察.据此,Mirkin[8]等利用DNA的互补识别作用把表面修饰有寡聚核苷酸的金纳米粒子作为2种探针,当被修饰的纳米探针混合后不发生团聚,引起离子共振吸收在520nm呈红色,加入靶标核苷酸,若靶标物同时与纳米探针的核苷酸杂交,则金纳米粒子通过双链DNA形成二维、三维的网状团聚结构,且共振频移至700nm,颜色从红色变成紫色;若杂交后点滴到反相硅胶板上,颜色从红色变成蓝色,通过目测观察就可以快速识别靶标物.基于此建立了DNA的分析检测法,具有简便、快速、灵敏等特点[9].同时,利用金纳米粒子对荧光的猝灭作用,把一端连有荧光基团另一端连有巯基的特定序列的寡聚核苷酸偶合到金纳米晶体上,制成核苷酸均相分析探针,这种探针产生的信号比传统标记方法强,灵敏度可提高100倍[10].Natan[11]研究组利用金纳米粒子放大SPR超灵敏检测DNA杂交,检测限可达到10nmol/m3,比未经放大相比提高了1000倍以上.表面等离子体共振成像(SPRI)是在SPR的基础上发展起来的一种新的检测方法.Li[12,13]和Mirkin[14]利用这种检测方法分别建立了检测DNA 基因组中单链核苷酸多形态和家庭检测DNA的新方法.此外,Marta[15]等还利用硅可以增强红外信号的特点与金纳米标记DNA技术结合使方法检出限降低了一个数量级.

共振散射光(RL S)是指当入射光波长接近于微粒吸收带时,即散射光频率接近或等于散射微粒电子吸收频率时,瑞利散射将偏离瑞利定律且某些波长的强度将急剧提高的现象.金纳米溶液存在共振

收稿日期:2007205223;　修订日期:2007207217.

基金项目:国家自然科学基金(No.20667001、20365001)、广西自然科学基金(No.0728213)和广西新世纪十百千人才工程计划资助项目.

作者简介:梁月园,女,在读硕士研究生,研究方向为生化分析.

散射效应[3].Paul[16]等用共振散射光检测DNA杂交.方法是先将标记有补体(Cy3)和生物素的人体肺细胞DNA与互补的DNA链杂交后用荧光扫描以检测DNA的杂交情况,之后将杂交体与用80nm 金纳米粒子标记的抗生素结合,然后再用共振散射光检测DNA的杂交情况.结果表明在探针浓度比较底(83.3p g/μL)的情况下,用金纳米标记以后的共振散射光检测比用补体标记后直接用荧光检测灵敏度高.

金标银染色技术是将金纳米粒子在标记中的优势与银的光学性质相结合通过将检测信号放大的一种新的标记技术[17,18].赵立凡[19]等报导了金标银染色技术可以将信号即可放大105倍,并可以通过肉眼直接观察.该方法检测单链核酸的灵敏度为0.1

f mol/L,双链为10f mol/L.

1.2　电学检测

金纳米标记分析过程中出现的金纳米大量聚集使体系的电导增强,使金纳米应用于电化学标记成为可能[20～23].Aut hier[24]等利用金纳米标记的寡核苷酸探针与互补DNA杂交后,在酸性条件下溶出金离子,利用阳极溶出伏安法检测金离子产生的信号,并且金离子和DNA之间存在一定的信号2浓度关系,从而可间接检测DNA的含量,该方法的检测限可达5×10-12mol/L.运用同样的检测方法,以金纳米为载体可以建立多标记电化学发光DNA杂交检测的新方法[25].例如,王辉[26]等用于检测囊肿纤维DNA片段的线性范围为1.0×10-12～10×10-9 mol/L,检出限为5.0×10-13mol/L.李金花[27]等将功能化的金纳米用于DNA的电化学检测和序列分析.实验显示172mer的DNA在浓度范围为0.001～10nmol/L存在线性关系,检出限为0175×10-12 mol/L.金标银染色技术在电学检测上也有广泛的应用.例如,王美佳[28]等利用银包金的核壳结构间接检测目标DNA,线性范围为100～1000p mol/L,检测限为10p mol/L.

1.3　芯片检测

芯片是将生物化学领域所涉及的基本操作单元集成或基本集成在一块几平方厘米的芯片上,以快速、简便的方法完成检测.Nie[29]等将金纳米标记的DNA“表面2侵入2分离”反应和扫描电子显微镜成像技术相结合应用于DNA的芯片检测中,实现了对DNA的定量检测.DNA的浓度和扫描电子显微镜从芯片上所检测到的信号在浓度为10-18～10-15

mol的范围内呈线形关系.Part[30]等将寡核苷酸功能化的金纳米粒子与靶DNA和捕获探针杂交结合后,利用金纳米探针和DNA杂交结合与盐浓度之间的关系来提高方法选择性.该方法能检测到浓度为500f M靶DNA,具有大约100000:1选择因子.金纳米粒子和银粒子具有表面增强拉曼光谱的性质,在利用寡核苷酸和具有拉曼活性的染料标记的金纳米探针进行多元寡核苷酸靶(其中包括6个不同的DNA靶和2个具有核苷酸多态性的RNA)的检测中[31],进一步确立了金纳米粒子探针-银复合物作为芯片微阵列窄带光谱指纹的设计.

2　金纳米粒子在蛋白质检测中的应用金纳米粒子标记蛋白质的原理,是由于金纳米表面带有较多的电荷,当蛋白质在p H值等于或稍大于蛋白质等电点时,蛋白质呈电中性,此时蛋白质与金纳米相互之间的静电作用较小,但蛋白质分子的表面张力却很大,处于微弱的水化状态,较易吸附于金纳米颗粒的表面,从而获得金纳米标记的蛋白质[32].例如,Y ou[33]等用凝胶电泳、电动电位差、圆二色谱和荧光光谱研究了用金纳米标记修饰有不同基团的L2氨基酸与α2胰凝乳蛋白酶结合时的静电作用和疏水作用.Li[34]成功的利用发光金纳米标记羊抗人Ig G.

2.1　光学检测

金纳米粒子具有强荧光猝灭作用,能使荧光染料猝灭.基于此原理,Limei[35]等建立了一种基于金纳米粒子荧光猝灭测定抗原的方法.方法是先将多克隆抗2α2甲胎蛋白固定在具有磁性的纳米粒子上,与相应的α2甲胎蛋白发生免疫结合反应后,再与金纳米标记的单克隆α2甲胎蛋白抗体反应形成具有“三明治”结构的复合物.随后,通过磁场将复合物与未反应的金纳米探针分离.上清液中含有未反应的金纳米探针,加入荧光染料异硫氰酸酯后,金纳米探针可使异硫氰酸酯荧光猝灭,且猝灭的强度与α2甲胎蛋白的浓度在15～400ng/mL范围内呈线性关系,方法检出限为12ng/mL(0.17nmol/L).用于检测病人的血清并与传统的放射免疫分析法做对比实验用.结果表明,2种方法检测的结果基本吻合. Jiang[36,37]等利用金纳米的共振散射效应,检测载脂蛋白A I和载脂蛋白B,2个体系的线性范围分别为8.33～333.33ng/mL、1.97～197.17ng/mL,检出限分别为2.04ng/mL和0.96ng/mL.此外,金纳

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