第20章基因治疗

（三）基因干预
基因干预(gene interference)
指采用特定的方式抑制某个基因的表达，
或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到
治疗疾病的目的。 1. 反义核酸： 封闭基因表达 2. 核酶： 裂解特异的靶mRNA
3. RNA干涉技术：
（四）自杀基因治疗


自杀基因治疗 : 恶性肿瘤基因治疗的主要方 法之一。 原理 : 将“自杀”基因导入宿主细胞中，这 种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化 为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀” 效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。
腺病毒的优点
1.基因导入效率高，对人类安全； 2.宿主范围广； 3.基因转导与细胞分裂无关； 4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸 入或气管内滴注； 5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；
腺病毒载体缺点
1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞， 导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达 时间相对较短。 2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。 (1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同 源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺 病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。 4.靶向性差。
逆转录病毒载体的主要缺点

随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危 险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳7 kb以 下的外源基因。

（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体
腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA 病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内， 腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒宿主细胞范围广，可感染分裂和非分 裂终末分化细胞，如神经元等。
脂质体介导的基因转移示意图
脂质体介导法缺点：
脂质体介导进入靶细胞内，易被单核吞噬细胞系统选择性吞噬、降解。
（2）受体介导转移技术
将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可 使 DNA 具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离 子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体 共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的 DNA 结合，将 DNA 包围，只留下配体暴露于表面。 这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞 吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。
二、基因转移技术
The Technique of Gene Transfer
基因治疗的两种途径
ex vivo
靶细胞
载体 目的基因
in vivo
基因治疗途径
1、间接体内治疗途径（ex vivo）
将靶细胞在体外导入外源基因及体外增殖、筛选、 药物处理或其他操作后，再输回患者体内（安全、易 控制但操作复杂）
AAV载体的缺陷：
AAV载体容量小，目前最多只能 容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%-80%的成人中存在过感染， 可能会引起免疫排斥。
2.非病毒载体介导的基因转移系统
（1）脂质体介导的基因转移技术
脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可 以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育， 即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至 细胞内，并进行表达。

生殖细胞(germline) 基因治疗

1973年第一例人体实验
1978年第二例基因治疗实验 基因治疗动物实验广泛开展
Dr Anderson （ 1980 ）首先阐明 基因治疗前景和发展方向 Rosenberg （ 1990 ）利用逆转录 病毒将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞 （ TIL ），并将 TIF 输回体内， TIF 集中 在肿瘤部位，表达neoR。
第20章 基因治疗
一、概念： 经典的基因治疗：指正常的基因整合入 细胞基因组以校正或臵换致病基因的一 种治疗方法。 广义的基因治疗：将某种遗传物质转移 到患者细胞内，使其在体内发挥作用， 以达到治疗疾病目的的方法。
基因治疗分类

体细胞(somatic cell) 基因治疗


只限于某一体细胞的 基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进 行矫正 当代及子代
（1）逆转录病毒
Retrovirus
逆转录病毒前病毒的结构特点
（1）两端各有一长末端重复序列LTR。 （2）LTR由U3、R和U5三部分组成。
(1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和 U5两端分别有病毒整合序列 (IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。
逆转录病毒前病毒的结构特点
2、直接体内治疗途径（in vivo）
将目的基因体内直接转移到靶细胞，所用载体必须 具有特异的导向性和转移效率。（操作简单但疗效短、 免疫排斥等）
基因转移(gene transfer)技术：
1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。
1.病毒介导的基因转移系统
病毒载体介导的基因转移效率较高，因 此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计， 有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病 毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。
动物细胞膜上的特wenku.baidu.com性受体识别，从而使逆转录病毒携带 的遗传物质高效地进入靶细胞。 ②逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部 分的活性。 ③前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因 在靶细胞中的永久表达。 ④包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载 体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于 分离制备。
逆转录病毒载体
LTR
φ
目的基因
标记基因
LTR
重组逆转录病毒 (核酸部分只能是逆转 录病毒载体)
4
1
3
2
LTR gag pol env LTR
5 辅病毒
LTR 目的基因 标记基因 LTR
Gag蛋白 PoL蛋白 Env蛋白 包装细胞系 靶细胞
假病毒颗粒的产生并感染靶细胞
逆转录病毒载体的特点
①逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳
2. 旁观者效应
旁观者效应 :“ 自杀基因”治疗不仅使转导 了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死， 而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细 胞也被杀死。
（五）基因免疫治疗
通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导 入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫 反应。

基因修饰肿瘤细胞的疫苗疗法 基因修饰TIL的过继免疫疗法 免疫增强基因疗法 原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法
二、基因治疗的必要条件
1. 2.
3.
发病机制在DNA水平上已经清楚； 要转移的基因已经克隆分离，其表达产物 有详尽的了解； 该基因正常表达的组织可在体外进行遗传 操作；
理想的基因治疗还必须：
1. 2.
3.
4.
外源基因可有效导入靶细胞 外源基因能在靶细胞中长期稳定存留 导入基因能适量表达 导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害
（3）腺病毒相关病毒载体（AVV)
腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是 一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb， 无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制， 只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病 毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只 能建立溶源性潜伏感染。
基因同源重组技术

又称为基因打靶(gene targeting） 定点整合的条件 : 转导基因的载体与染色 体上的DNA具有相同的序列。带有目的基 因的载体就能找到同源重组的位点，进行 部分基因序列的交换，使基因臵换这一治 疗策略得以实现。


要实现基因臵换，需要采用同源重组技术 使相应的正常基因定向导入受体细胞的基 因缺陷部位。 定向导入的发生率约 1/100万，采用胚胎干 细胞培养的方法，这种同源重组的检出率 最高可达1/10。
AAV Virus Particles
Structure of AAV Virus Genomic DNA
REP:病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因
AAV的特点
● 以潜伏感染为主； ● 病毒基因组与细胞共存； ● 只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑 制而维持潜伏状态； ● 若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表 达从而使AAV病毒复制； ● 产生子代病毒并释放，又感染新的细胞， 建立新的潜伏状态。
一、基因治疗的策略
The Strategy of Gene Therapy
（一）基因臵换（gene replacement）
定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通 过定位重组，以导入的正常基因臵换基因组内原 有的缺陷基因。 目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复， 不涉及基因组的任何改变。
（3）病毒有三个结构基因 (1)gag基因，编码核心蛋白及属特异性抗原；
(2)pol基因，编码逆转录酶；
(3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括 外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 （ 4 ） 5ˊ 端 LTR 下游有一段病毒包装所必需的包装信号序列 （ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。
Retroviral packaging system
PA317 cell gag
LTR Pro therapeuticgene LTR
pol
env
Vector DNA
rRV particles
Retroviral vector pakaging system: Virus producing cells, VPC
缺点：受体介导的DNA通常进入细胞溶酶体内被降解。
AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载 体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特 定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。 这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带 来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性， 而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围 基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体 两者的优点。
1990 年 9 月 14 日：第一例正式批准的基因治 疗实验开始进行 （美国，世界上开展基因治疗最早的国家）大 规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段： 体外试验和动物试验 I期临床试验——6---10名志愿者 II期临床试验——20---30名志愿者 III期临床试验——充分分析疗效、安全性 中国 1991年7月开始进行基因治疗试验
逆转录病毒前病毒的结构特点
（ 5 ）含有负链 DNA 转录的引物结合位点 (PBS) 和正链 DNA 转 录的引物结合位点(PPT)。
构成逆转录病毒介导的基因转移系统 ——逆转录病毒载体由两部分组成：
(1)保留病毒颗粒的包装信号而缺失病毒蛋白基因
(2) 辅助细胞株 (如PA317)：它由缺陷型逆转录 病毒感染构建而成
基因置换必要条件：
1、对导入的基因及其产物有详尽的了解
2、外来基因能有效地导入靶细胞 3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在
4、导入基因能有适度水平的表达
5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全 无害
（二） 基因添加
基因添加或称基因增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达 的基因。 类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因， 而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常 基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利 用其表达产物达到治疗疾病的目的。
自杀基因的作用机制
1.自杀基因系统
☻TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）Ⅰ 型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激 酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷 （ ganciclovir, GCV ）转变成毒性 GCV 三磷酸核苷， 后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。 ☻CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD ）基因，在细胞内将无毒性 5- 氟胞嘧啶（ 5-FC ） 转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。 5-氟尿嘧啶通过竞争性抑制胸苷酸合酶的活性，从而 抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。