多克隆抗体的制备

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缺点:特异性不高,易发生交叉反应,
从而应用受限。
三、实验试剂与材料

动物:健康家兔
抗原:生化大实验中制备的LDL


佐剂:弗氏佐剂
注射器、研钵 等
动物的选择

动物的选择常根据抗体的用途和量来决定,也
与抗原的性质有关 如要获得大剂量的抗体,则采用大动物; 如要获得直接标记诊断用的抗体,则直接采用 本动物; 如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异 源动物制备抗体


抗原

不同的抗原,其免疫原性的强弱均不相同,
这种免疫原性的强弱取决于抗原的分子量、
化学活性基团、立体结构、物理形状和弥 散速度等

本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL (至少有2mg,如量不够则用牛血清白蛋 白),用生理盐水溶解。
抗原剂量的选择

抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类,免疫 次数,注射途径,以及受体动物的种类,免 疫周期及所要求的抗体特性等而不同。
思考题

佐剂的种类有哪些? 佐剂的作用原理是什么?有何用途


弗氏佐剂中弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐 剂有何区别? 抗原的免疫原性与哪些因素有关?
第一次加强免疫
实验目的
1.掌握多克隆抗体的应答特点 2.理解加强免疫的作用和必要性
3.加强动物技能
实验原理

体液免疫的一般规律
在抗原诱导下,浆细胞产生的抗体经淋巴液
(1)增加抗原的表面积,并改变抗原的活性基团构 型,从而增强抗原的免疫原性;
(2)佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留 时间,减低抗原的分解速度,使抗原缓慢释放至淋巴 系统中,持续刺激机体产生高滴度的抗体; (3)佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之 增生,从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免 疫功能;
多克隆抗体制备的意义

免疫血清:将抗原注入机体所产生的抗体
是针对多种抗原决定簇的混合抗体,含有 这种特异性抗体的血清。

免疫血清作用:对传染病的诊断、预防和
治疗有重要意义,而且对器官移植,肿瘤 以及某些科研工作也有重要意义。

多克隆抗体优缺点: 优点 :作用全面,具有中和抗原,免疫
调理,介导补体介导的细胞毒作用,ADCC 等作用,来源广泛,制备容易。

双向免疫扩散
wk.baidu.com

第二次加强免疫

实验原理及方法同第一次加强免疫
效价测定

取血分离血清 双向免疫扩散——效价测定
血清采集与处理
取血方法: 耳缘静脉取血、颈动脉取血等。 血清处理: 取好血后,放入37℃,30min后,使血 清充分析出(不能冰冻,否则产生溶血), 经3000rpm/5min分离血清,剩余放进20℃冰箱保存。
对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特 异性免疫增强性物质。

种类:一种本身具有免疫原性,如百日咳杆菌、
抗酸杆菌(结核分枝杆菌)以及革兰阴性杆菌等; 另一种本身无免疫原性,如氢氧化铝、磷酸钙、 矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是 弗氏佐剂。
佐剂
佐剂的条件作为一种良好的佐剂,必须具备下列条件:
2-4周
第一次加强免疫
2-3周
第二次加强免疫
7天
效价测定
第一次免疫(基础免疫)
免疫乳剂的制备 ①研磨法: 取1.2ml佐剂加入到无菌的研钵中,缓慢加 入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液,每加一滴 研磨至小滴消失,边加边往同一个方向研磨, 抗原全部加入后继续研磨至乳白色粘稠的油 包水乳剂。

①研磨法

单克隆抗体:抗原通常是由多个抗原决定簇 组成的,由一种抗原决定簇激活具有相应抗 原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇 的抗体,称为· · ·
多克隆抗体
天然抗原分子中常含有多种不同抗 原特异性的抗原表位,以该抗原物质刺 激机体免疫系统,体内多个B细胞克隆被 激活,产生的抗体中含有针对多种不同 抗原表位的免疫球蛋白,称为多克隆抗 体。


本法适于制备大量的佐剂抗原,缺点是研 钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大。 注意事项:
⑴每加一滴应研磨至小滴消失,滴加速度要 慢
⑵边加边往同一方向研磨,否则不易制成乳 白色粘稠的油包水乳剂,免疫效果就差。
免疫乳剂的制备
②注射器法:
取1.2ml佐剂+1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液, 用两个注射器用皮管对接,使佐剂和抗原往 返推拉,直至乳化完全。 适用于制备少量的抗原乳剂。 本法优点是容易做到无菌操作,抗原损失少。
稀释
颗粒性抗原多克隆抗体的制备—— 伤害杆菌O抗血清的制备(介绍)
2、免疫方法: 选择体重2-3kg的健康家兔,将已经稀释好 的抗原按下列剂量及程序做皮内注射。第 一天注射1ml,第8天注射1ml,第15天注射 2ml,末次注射后7天颈动脉放血,测效价。
可溶性抗原多克隆抗体的制备
第一次免疫(基础免疫)
(4)良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。
佐剂
主要作用机制:
①改变抗原物理性状,延缓抗原的降解和排 除,延长抗原在体内滞留的时间 ②刺激单核-巨噬细胞系统,增强其对抗原的 处理和提呈能力 ③刺激淋巴细胞的增殖分化,从而增强和扩 大免疫应答的能力
佐剂
主要用途:
①增强特异性免疫应答,用于预防接种 及制备动物免疫血清 ②作为非特异性免疫增强剂,用于抗肿 瘤与抗感染的辅助治疗


动物的选择

如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,
则可以采用纯系小鼠制备 免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动 物,免疫时应同时选用数只动物进行免疫 一般实验室采用的抗体,多用兔子和羊;


抗原

就其化学成分而言,有蛋白质抗原、类脂抗
原、多糖类抗原和核酸抗原等. 根据物理性状可分为颗粒型抗原和可溶性抗 原。 就抗原性而言,有完全抗原和不完全抗原。 为了获得较好的抗血清,最好是选用蛋白质
实验一 多克隆抗体制备
微生物与免疫教研室 周芳美
一、实验目的

掌握多抗制备的原理和过程 熟悉常用的佐剂 掌握福氏完全佐剂的作用机理和制备方法 掌握研磨法和注射器法制备免疫乳剂,掌握 制备成功的判别标准 掌握动物的免疫方法


二、实验原理

抗体:介导体液免疫的重要效应分子,是B
细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合 成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、 具有免疫功能的球蛋白。
弗氏佐剂
动物实验中最常用的佐剂: ①弗氏不完全佐剂(incomplete Freund's adjuvant IFA)
羊毛脂 1 份 +石蜡油 5 份,混合,高压灭菌后保存。 用时加热融化,冷却至50℃左右,加抗原进行乳化处理。
②弗氏完全佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)
剂量过低,不能形成足够强的免疫刺激 剂量过高,有可能造成耐受


在一定范围内,抗体效价随注射抗原的剂量 而增高。
抗原剂量的选择


小鼠首次抗原剂量为:50-400μg/次
大鼠为100-1000μg/次


兔子为200-1000μg/次
加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5
佐剂

概念:预先与抗原同时注入体内,可增强机体
弗氏不完全佐剂 10ml +卡介苗 10mg~200mg 卡介苗可100℃10min灭活处理。
四、步骤和方法
颗粒性抗原多克隆抗体的制备——伤害杆 菌O抗血清的制备(介绍) 1、伤害杆菌O抗原的制备:

接种 过滤 得到原液 洗下菌苔 37℃ (用NS) 100 4000r/min, ℃ 1h 18-24h 20min 109/ml应用液
免疫乳剂制备成功的判别标准

油包水状态 鉴定方法是将乳化剂滴入4℃左右冷水中, 若保持完整不分散,成滴状浮于水面,即 乳化完全,为合格的油包水剂。
免疫



将制成的乳剂吸入注射器,在兔子背部及 颈部皮下注射8-10点,每点约0.2ml 每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全 抗原中,在皮下多点注射加强免疫,每点 0.2ml,共加强2次。 第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免 疫双扩散法检查抗体效价。
加强免疫的作用和必要性

再次应答,增加抗体量 增强抗体的亲和力
材料和试剂

试剂:LDL抗原溶液,佐剂
材料:注射器,研钵,消毒棉球
实验步骤
免疫乳剂的制备(注射器法和研钵法任选) 取抗原溶液(基础免疫的2/5)+弗氏不完全 佐剂制备成油包水状态. 免疫 将制成的乳剂吸入注射器,在兔子背部及颈 部皮下注射,每点约0.2ml.
和血液流向全身,血液中抗体的浓度随应答
时间的持续而增高。在初次接受抗原刺激中,
机体发生初次应答,再次接受相同抗原刺激,
机体产生二次应答或称回忆应答。
初次应答和再次应答的特点和比较
初次应答 潜伏期 抗体类型 长,5-10天 再次应答
抗体浓度
持续时间
短,2-5天,约为初 次应答的一半 低亲和力的IgM类抗 高亲和力的IgG类 体为主 抗体为主 低 高 较短 长
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