6-毛细管电泳

——毛细管电泳中使用最为广泛的一种技术。
(1)基本原理
①电渗效应与电渗淌度
在熔融毛细管内壁的
Si-OH解离为硅氧基(Si-O-)-阴离子与H+。H+与H2O 结合，生成H3O+。由于硅氧基吸引了缓冲溶液中阳 离子，在毛细管内壁表面带形成双电层。双电层外 缘的扩散层中的阳离子被电场阴极吸引导致背景电
解质缓冲溶液向阴极流动，形成电渗流——电渗效
4种成分 Inc.,USA),HV-30高压电源
仪器： VUV-20 毛细管电泳紫外检测器 (Hyper Quan ，
英毛细管：60cm×75μ m i.d.，有效长度50cm；
紫外检测波长：240nm、灵敏度0．01AUFS；
运行电压：14kV；
背景电解质： 0.2mol ／ L 硼酸 -20mmol ／ L SDS-5 ％乙腈(V／V，氢氧化钠调PH至10.5)。
ep)。
ep)。
⑤ 电泳淌度 ——荷电质点在单位电场强度下的
⑥ 双电层
⑦ 分离度 为，
当固体与液体接触时，固 —液两相
毛细管电泳色谱中，分离度可表示
界面上就会带有相反符号的电荷，形成双电层。
R = (n1/2/4)×(△V / V)
n—平均理论塔板数
△V—两组分迁移速度的差值
V—平均迁移速度
(2) 电泳法的分类
快的组分通过检测窗口所需要的时间较短，反之则 较长。
液相色谱的柱后检测：被分离组分流出的次序不 同，却都以相同的速度被流动相洗脱经过装在柱后 的检测窗口，所展示的峰宽只是色谱过程的函数， 并不关系到谱带通过流通池的速率。 电泳检测器分为：
通用型：如示差折光检测器(RID)，测定流出物
的折光系数，灵敏度较低。 选择型：如紫外(UVD)、荧光(FD)、电化学(ECD) 等检测器对被测物质的响应有特异性，灵敏度较高。 紫外检测器和荧光检测器是目前使用最广的两种
电泳条件
运 行 电 压 16kV ， 室 温 ， 检 测 波 长
254nm，重力(虹吸)进样10s。
分离条件的选择
——缓冲溶液、电压及毛细
管规格。缓冲液的优化包括pH值、电解质浓度等， pH值对CE分离和迁移时间的影响最大。
结合核苷的特性考察了中性和碱性三种缓冲液系
带电质点的电荷数量、电荷符号与质点大小的差别
→迁移速度不同→分离。
② 电泳法 —— 利用电泳现象进行定性、定量的 分离分析方法。 ③毛细管电泳法 (CE)——在毛细管中进行的电
泳法。 又称高效毛细管电泳法(HPCE)。
④ 电泳速度 ——荷电质点在电场的作用下，在
电解质溶液中的迁移速度 (ν
电泳速度（μ
腺苷含量研究发现，冬虫夏草及蛹虫草都含有腺
苷，—些代用品的腺苷含量反而高于自然品，所以， 不能只用腺苷鉴别冬虫夏草及其代用品。
图 11个品种虫草药材的腺苷含量柱状图
1.道地冬虫夏草；2.畸形冬虫夏草；3.蛹虫草菌皮；4～9.不同产地 的冬虫夏草样品；10.蛹虫草子座；11.蛹虫草虫体
由于冬虫夏草所含成分复杂，虽然目前有效成 分尚不十分明确，但对核苷类物质的研究较多，而 且虫草的毛细管电泳色谱指纹图谱中核苷类物质具
药材
冬虫夏草由西藏、青海、四川、云南、
贵州等地产13个药材样品。 (2)分离条件 实 验 前 ， 用 0.1mol ／ LNaOH 溶 液 填 充 毛 细 管 柱 30min ，再分别依次用水、 0.1mol ／ LHCl 溶液、水、
0.1mol ／ LNaoH 溶液、水及运行缓冲液清洗毛细管
2min。
电渗流的速度，因而缓慢随电渗流向阴极迁移。组分 在两相中的分配系数Kmw可表示为，
Kmw = Cm/Cw
Cm、Cw——组分在胶束相、水相的浓度
组分的分配系数越大，迁移速度越慢。故不同性
质的中性分子，可在胶束电动毛细管色谱中被分离。 而在 CZE 中，不论中性分子的性质如何，其迁移速度 都等于电渗流的速度，故无法分离。 胶束相在电场中泳动(电动)，分离机制是依据中性
虹吸作用，将样品吸入。
在气动进样法中，进样量也取决于进样区带的长
度，与通过毛细管截面的压差、样品浓度、进样时 间及管径的四次方成正比，而与黏度和管长成反比， 与组分的淌度无关。——气动进样的优点 (3)进样的注意事项
①毛细管插入样品溶液，应立即进样操作，并在
进样后迅速将其从样品槽移至缓冲液中开始运行， 否则产生毛细作用及虹吸现象，谱带展宽。 ②避免电极和毛细管接触，毛细作用可能导致进 样时样品区带出现间断现象，使定量精度降低，区
平板电泳法：电泳在平面电解质溶液中 支持体形状 进行(电解质支持体为平板形),如 纸电泳法及平板凝胶电泳法。 柱电泳法：电解质溶液充填于柱状容器 中 , 电泳在柱状电解质溶液中进行。 （柱区带电泳法、柱凝胶电泳法） 电泳柱粗细 经典柱电泳法(cm id,低压电泳法) 毛细管电泳法(μ m id,高压电泳法)
CE
(3) 毛细管电泳的流路 毛细管作站等部分组成。熔融毛
细管柱(长约30～100cm，内径75μ m)一端由进样装
置吸入样品，另一端
经过检测器。毛细
管两端插入电解质 贮液槽中，加约20 ～30kV的稳定高电 压。
2.毛细管区带电泳法
——毛细管中只充填背景电解质溶液，组分靠 电泳淌度的差别而进行分离的电泳法(CZE)。
60cm×75um(i.d.)，有效长度48cm。 PHS-10B数字酸度计等。 试剂 对照品 甲醇(色谱纯)，硼砂、磷酸二氢钠(分析 腺苷、尿苷(中国药品生物制品检定
纯)，磷酸、氢氧化钠(分析纯)。 所 ）；虫草素(Fluka公司）；次黄嘌呤核苷
（(Sigma公司)；头孢唑啉钠(原料药，东北制药总 厂)；鸟苷、腺嘌呤、脱氧胸腺核苷、次黄嘌呤、尿 嘧啶（生化试剂，均为上海试剂二厂生产，经纯化 后用TLC和HPLC测定含量均大于99.8％）。
分子的分配系数差别——色谱分离行为，故称为胶
束电动毛细管色谱法。
MEKCC
具有色谱与电泳两种行为 ——很好的选择性。
有各种阴、阳离子表面活性剂可供选择
——各种类型样品的分离。
胶束电动毛细管色谱的分离机制示意图
(2)表面活性剂
阴离子表面活性剂： 在水溶液中可形成负胶束
十二烷基硫酸钠(SDS)
阳离子表面活性剂： 在水溶液中可形成正胶束 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) (3)应用实例 用胶束电动毛细管色谱法测定中药六味地黄丸中的
有很高的特征性，因此，以核苷类物质为重点考察
色谱峰的虫草指纹图谱的特征及与代用品、伪劣品
的鉴别研究具有实用价值。
1.实验 (1)仪器、试剂和样品 Unimicro 简易型毛细管电泳仪 HV 301 高压电 源 (0 ～ 30kV) ， Hyper Quan VUV-20 紫外检测器，外
配Ecrom98色谱工作站；石英毛细管
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是冬虫夏草
菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫蝙蝠蛾幼虫上的子座 及幼虫尸体的复合体。有补肺益肾、止血化痰功
效，为我国传统的强壮滋补名贵药材。 代用品及伪劣品时有发现。 《药典》规定以腺苷作为冬虫夏草 质量鉴定指标，要求用HPLC法测定其
含量不得少于0.010％。而这种单一的腺苷含量鉴定 指标已不足区别天然品和代用品。11个品种药材的
ep<0 ；中性分子，电泳速度为 0 ，跟随介质电渗流
向阴极移动。 阴离子 μ
阳离子 μ
app=μ eo-μ ep
app=μ eo+μ ep
中性分子 μ
app=μ eo
μapp(阳)＞μeo(中)＞μapp(阴)
表观淌度(μ
app)的计算式：
μ
app=V/E=(Ld/t)/(V/Lt)
V——某质点的电泳速度(迁移速度) E——电位梯度 V——电压 t——迁移时间 Ld——从进样口到检测器的有效毛细管柱长度， Lt——毛细柱总长度 组分的电渗淌度与其荷电情况及背景电解质的性质
②表观淌度 (μ
eo)之和。
——CE中离子被观测到的淌度，
ep)和背景电解质溶液电渗淌度 app=μ ep+μ eo
即离子电泳淌度(μ μ
电渗淌度 μ
其μ μ
eo 恒大于 0 。带正电荷阳离子的 μ ep>0 ，
app 总为正，向阴极移动；带负电荷阴离子其电
泳方向指向阳极，与缓冲溶液的电渗流的方向相反，
分离模式: （毛细管电泳）
毛细管区带电泳法(CZE) 胶束电动毛细管色谱法(MEKC) OTCE（开口CE） 环糊精电动毛细管色谱法(CDEKC) 亲和毛细管电泳(ACE) 化学键合相电色谱法(CEC或 BPCE) 毛细管凝胶电泳法(CGE) PCE（填充CE） 毛细管等电聚焦电泳法(CIEF) 毛细管等速电泳法(CITP)
1.莫罗苷 2.番木鳖苷
3.芍药苷 4.内标物 (氯霉素) 5.丹皮酚
4.毛细管电泳法的进样技术
快速 毛细管电 泳 进样要 求 分离样品组 高效 分 进样时不能引入显著的区带扩张， 以确保系统的高效；
样品量必须小于100nl。否则易
造成过载。
适宜的进样区带宽度大体是毛细管长度的 1 ％～ 2 ％。进样宽度越大，柱效越低。进样引起的区带展 宽应小于由扩散引起的宽度。
应，
双电层的扩散层与溶液内部的电位差——ζ 电位。
电渗流的迁移速度Veo与电压、ζ 电位等有关。用单
位电场强度下的电渗流的速度——电渗淌度(μ
质的黏度有关 μ
eo
eo)
描述电渗流的速度。电渗淌度与ζ 电位和背景电解 =Veo/E=ε ζ /η
Veo——电渗流迁移速度
E——电场强度(电压)，
η 、ε ——背景电解质的黏度、介电常 数
(1) 电动进样 —— 电迁移进样。毛细管的进样端 ( 阳极端 ) 先不与缓冲液接触，而直接置于样品溶液 中，然后在短时间内加进样电压，使样品通过电迁
移进入毛细管。可通过改变进样电压(决定电泳迁移
速度和电渗流速度)和时间(与样品区带长度有关)控
制进样量。（与溶质的淌度和缓冲液的淌度有关）
(2)气动进样——压差进样，最常用的进样方法, 具体办法有三种： ①在进样端加压； ②在出口端减压； ③调节进样槽与出口槽之间的相对高度使之产生
带展宽或峰分裂。
③只要检测器的灵敏度能提供足够的信号强度，
进样区带越小越好，加大进样区带会使柱效和分离 度降低。 ④温度对进样体积的影响。 ⑤样品溶液中的溶剂必须是能和运行缓冲液互溶
的并不引起后者的沉淀；溶剂的离子强度要低于运
行缓冲液的离子强度。 ⑥关于样品溶液和缓冲液的损耗和蒸发问题。毛 细管和电极都相对较细，需要用合适的封闭装 置．以防上蒸发；用大体积的缓冲液或频繁更换缓
（四）毛细管电泳法
以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道， 依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而 实现分离的一种液相分离技术。 特点——分离效率高、分析速度快、分离模式
多、直接分析水溶液。
1.概述
(1)基本概念
① 电泳 —— 带电质点 ( 离子或胶粒 ) 在电解质溶 液中在电场作用下,向荷电相反电极的迁移现象。
冲液，防损耗。
5.毛细管电泳法的检测器
电泳毛细管的直径极小，产生的样品组分谱带体 积也极小——检测器对组分既灵敏检测，又不使其 微小的区带展宽。——电泳柱上检测 毛细管的柱上检测： 峰宽对迁移时间所表现的依
赖性，组分通过毛细管的迁移速率是电泳力和电渗
力的函数，检测发生在柱上，故当组分通过检测窗
口时仍然受到电泳力和电渗力的作用，因此移动较
检测手段。
紫外检测器的灵敏度低一些，特别是对小直径的
毛细管而言，但是它的通用性好，特别是对蛋白质
的适用性很强，因此在毛细管电泳中显示很大的用 途。 激光诱导荧光检测，灵敏度高，但大多数样品， 需要衍生。
质谱检测器，有潜在用途的，已经显示出极其广
泛的应用前景，并正在做深入的研究。
实例 研究
冬虫夏草及其代用品的指纹图谱
密切相关，电渗淌度对于电泳的分离状况影响甚大。
（2）实验方法
实例一
冬虫夏草及其代用品的指纹图谱研究
3.胶束电动毛细管色谱
(1)分离机制 胶束电动毛细管色谱与 CZE 不同，是在背景电解 质缓冲溶液中加入离子型表面活性剂。当表面活性剂
的浓度足够大，达到或超过临界胶束浓度 (CMC) 时，
则表面活性剂的单体结合在一起，形成球状胶束。 “胶束相”相当于“准固定相”，组分在水相与胶束 相间形成分配平衡，当胶束相与水相的性质一定时， 分配系数的大小取决于组分 (中性分子)的性质。由于 负胶束在电泳时，向阳极迁移与电渗流逆向泳动，因 其速度小于