超氧化物歧化酶的固定化及其酶学性质

以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，分两步制备
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中国生物制品学杂志 2009 年 2 月第 22 卷第 2 期 Chin J Biologicals February 2009，Vol. 22 No. 2
固定化超氧化物歧化酶。制备过程见图 1。 1. 2. 1 活化壳聚糖粉的制备：取 2. 0 g 壳聚糖粉 末，加入 25 ml 0. 3%的戊二醛溶液，室温下搅拌 3 h 后，于 4℃下放置过夜；次日抽滤，并用 50 ml 磷酸盐 缓冲液洗涤，得到淡黄色活化的壳聚糖粉末。 1. 2. 2 固定化酶的制备：取 0. 5 g 活化的壳聚糖粉 末，加入 10 ml 超氧化物歧化酶液，室温下搅拌 1. 5 h， 于 4℃下放置过夜；取少量上清液保存在 4℃待测， 将余下的混合物抽滤，并用 50 ml 磷酸盐缓冲液分 5 次洗涤，即得到固定化 SOD 酶粉。见图 1。 1. 2. 3 壳聚糖粉（空白对照）的制备：取 0. 5 g 活化 的壳聚糖粉末，加入 10 ml 小牛血清白蛋白液，室温 下搅拌 1. 5 h，于 4℃下放置过夜，抽滤，用 50 ml 磷 酸盐缓冲液分 5 次洗涤，即得空白对照壳聚糖粉。
表 1 溶液酶活力测定实验加样量 Tab 1. Samples loaded for activity test of SOD before im－ mobilization
离心管 Tris-HCl SOD 溶液 45 mmol ／ L 去离子水 5%维生素 C 编号 缓冲液（ml） 酶（μl） 邻苯三酚（μl） （μl） （μl）
作者单位：华中科技大学同济医学院药学院（武汉 430030）. 通讯作者：马长清，E-mail：cqingma@mails.tjmu.edu.cn
将 SOD 固定化，不仅能保持其原有特性，稳定 性也有很大提高，而且可重复使用。固定化酶可进一 步组装成酶传感器。本研究以壳聚糖为载体，戊二醛 为交联剂，对 SOD 进行固定，并对其贮存稳定性、热 稳定性、pH 稳定性等进行考察。
SOD 在药物、食品、日化等方面有着广泛的应 用，但由于其稳定性差、易失活、半衰期短等缺点，在 一定程度上限制了其应用。对此，许多研究者采用各 种方法对 SOD 进行修饰改造，如聚乙二醇、β-环糊 精、山梨醇月桂酸、右旋糖苷、聚蔗糖及肝素修饰等， 与天然 SOD 相比较，这些产品的生物学性质有不同 程度的改善［2］。
中国生物制品学杂志 2009 年 2 月第 22 卷第 2 期 Chin J Biologicals February 2009，Vol. 22 No. 2 中国图书分类号 Q554+. 9 Q814. 2 文献标识码 A 文章编号 1004-5503（2009）02-0153-05
超氧化物歧化酶的固定化及其酶学性质
准确反应 3 min，加入终止剂 5%维生素 C，在室温下 放置数分钟，3 200 g 离心 10 min，吸取上清液，测定 A325 值。按表 2 加样，以 1 号管溶液为空白，测定各 管的 A325 值。
表 2 固定化酶活力测定实验加样量
Tab 2. Samples loaded for activity test of SOD after immo－
bilization
离心管 Tris-HCl 空白 固定化 45 mmol ／ L 去离子 5%维生
编号 缓冲液 对照 酶（mg） 邻苯三酚 水（μl） 素 C（μl）
（ml） （mg）
（μl）
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0
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图 1 固定化酶的制备过程 Fig 1. Preparation of immobilized SOD
1. 材料与方法 1. 1 试剂
壳聚糖（脱乙酰度≥ 95%）购自济南海得贝海 洋生物工程有限公司；铜锌超氧化物歧化酶购自美 国 Sigma 公司；小牛血清白蛋白购自罗氏制药有限 公司；戊二醛 25%水溶液购自中国医药集团（上海） 化学试剂公司；维生素 C 购自天津市科源化学试剂 有限公司；邻苯三酚购自天津市标准科技有限公司； Tris 购自天津市博迪化工有限公司。 1. 2 固定化酶的制备
1. 3 酶活力的测定 1. 3. 1 溶液酶活力的测定：取 3 支带刻度的离心 管，将溶液酶加入 Tris-HCl 缓冲液（pH 8. 02）中预热 10 min 后，加入邻苯三酚，准确反应 3 min，加入终 止剂 5%维生素 C，室温放置 5 min 后测定 A325 值。 按表 1 加样，以 1 号管溶液为空白，测定各管的 A325 值。
自氧化抑制率达 50%）的酶量定义为 1 个酶活力单
位［ 3］。
邻苯三酚自氧化抑制率 α =（Ao-As）／ Ao × 100%
100% V
SOD 溶液酶酶活力（U ／ ml）= α ×
×
50% v
100% V
SOD 固定化酶酶活力（U ／ mg）= α ×
×
50% m
其中：V 为反应液的总体积，v 为溶液酶的加入
酶 300 mg，分别分装于 15 个离心管中，在室温条件
下保存，每天测定 3 次酶活力，连续检测 5 d。
1. 4. 2 热稳定性检测：取溶液酶 30 μl 和固定化酶
60 mg，分别分装于 3 个离心管中，置 85℃的恒温水
浴中，分别于 40、80 和 120 min 测定酶活力；将溶液
酶与固定化酶分别置于 25、35、45、55、65、75 和 85℃
【Abstract】 Objective To immobilize superoxide dismutase（SOD）and analyze its zymological property. Methods Immobi－ lized SOD was prepared using chitosan as carrier and glutaraldehyde as crosslinker. The activities of SOD before and after immobi－ lization were determined by pyrogallol autoxidation method, based on which the recovery rate of activity was calculated. The stabilities to temperature and pH value as well as half-life, activity retention after repeat usage and Km of immobilized SOD were determined. Results The activity, recovery rate of activity and half-life of immobilized SOD were 333 U ／ g, 86. 32% and 43. 8 d respectively. After storage at room temperature for 5 d, the relative activity of SOD was still more than 80%. The optimal reaction temperature of immobilized SOD was 45℃, and the activity retentions after being used for the first and second times were 70. 12% and 51. 72% re － spectively. Both the optimal pH values for SOD before and after immobilization were 6, while the Km values were 0. 16 and 0. 18 mmol ／ L respectively. Conclusion The stability of SOD after immobilization increased significantly as compared with that before immobiliza－ tion. The immobilized SOD was convenient to storage and of good prospect in various fields such as food, drug and articles of every － day use.
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1. 3. 2 固定化酶活力的测定：取 3 支带刻度的离心 管，将固定化酶及空白对照壳聚糖粉加入 Tris-HCl 缓冲液（pH 8. 02）中预热 10 min 后，加入邻苯三酚，
1. 3. 3 酶活力的计算：在 25℃条件下，1ml 反应液
中，每分钟使溶液 A325 值减小一半（即使邻苯三酚
【关键词】 超氧化物歧化酶；壳聚糖；戊二醛；固定化酶；酶学性质
Immobilization and Zymological Property of Superoxide Dismutase
LI Lei, MA Chang-qing, LIU Fei-ge, et al （School of Pharmacy, Tongji Medical College, Central China University of Science and Technology, Wuhan 430030, China）
李磊 马长清 刘飞鸽 李黎
·153· 【基础研究】
Biblioteka Baidu
【 摘要 】 目的 制备固定化超氧化物歧化酶（SOD），并分析其酶学性质。方法 以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，制备固 定化超氧化物歧化酶。以邻苯三酚自氧化法分别测定溶液酶与固定化酶的活力，并计算回收率。对固定化酶的温度和 pH 稳定 性、半衰期、重复使用的回收率及米氏常数（Km）进行测定。结果 固定化超氧化物歧化酶活力为 333 U ／ g，酶活回收率为 86. 32%， 半衰期为 43. 8 d；固定化酶室温保存 5 d 后，相对酶活力仍保持在 80%以上，最适反应温度为 45℃，使用一次后回收率为 70. 12%，重复使用两次后回收率为 51. 72%；固定化酶与溶液酶在 pH 6 时活性最强，Km 分别为 0. 18 mmol ／ L 和 0. 16 mmol ／ L。 结论 该固定化酶较溶液酶的稳定性得到提高，便于贮存，在食品、药品、日用品等领域有良好的应用前景。
量，m 为固定化酶的加入量，Ao 为自氧化速率，As 为
加入酶后的氧化速率。
1. 3. 4 回收率的计算：按下列公式进行。
回收率（%）= 固定化酶活力 ／（初始溶液酶活力-上清液
酶活力）× 100%
1. 4 溶液酶及固定化酶的温度稳定性检测
1. 4. 1 室温稳定性检测：取溶液酶 150 μl 和固定化
下 30 min，测定酶活力。
1. 5 溶液酶及固定化酶的 pH 稳定性检测
将固定化酶和溶液酶分别置于 pH 2 和 pH 13
的缓冲液中，分别于 40、80 和 120 min 测定酶活力。
将固定化酶和溶液酶分别置于 pH 2、4、6、8、10 和
13 的缓冲液中，放置 30 min，测定酶在不同 pH 条件
【Key words】 Superoxide dismutase（SOD）; Chitosan; Glutaraldehyde; Immobilized enzyme; Zymological property
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是 美国科学家 Mccord 和 Fridovich 于 1969 年从牛血 红细胞中发现的一种含有金属离子的酶，也是至今 为止发现的唯一的以自由基为底物的酶［1］。该酶能 专一地清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由 基（O2-），是机体对抗自由基的第一道防线，在维持 生物机体内自由基产生与清除的动态平衡过程中起 着极其重要的作用。