【CN110141563A】一种改善玫瑰痤疮症状的药物及其动物模型和构建方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379249.0

(22)申请日 2019.05.08

(71)申请人 中南大学湘雅医院

地址 410013 湖南省长沙市湘雅路87号

(72)发明人 张亦雅　邓智利　李吉　

(74)专利代理机构 重庆市信立达专利代理事务

所(普通合伙) 50230

代理人 包晓静

(51)Int.Cl.

A61K 31/195(2006.01)

A61P 17/10(2006.01)

A01K 67/027(2006.01)

C12N 5/071(2010.01)

C12Q 1/6851(2018.01)

(54)发明名称一种改善玫瑰痤疮症状的药物及其动物模型和构建方法(57)摘要本发明属于皮肤性疾病药剂技术领域，公开了一种改善玫瑰痤疮症状的药物及其动物模型和构建方法，采用7周龄BALB/C小鼠皮下注射LL37多肽2次/天注射2天以诱导玫瑰痤疮样皮肤损伤进行玫瑰痤疮造模；动物模型，小鼠提前5天灌胃氨甲环酸，药物对照组灌胃PBS缓冲溶液PBS，灌胃第6-7天诱导玫瑰痤疮样皮肤损伤。本发明通过使用LL37诱导的小鼠模型和HaCaT细胞模型评估了TXA对玫瑰痤疮影响及其分子机制；通过TXA处理显着改善了玫瑰痤疮样症状；此外，TXA降低了先天性免疫基因(TLR2，KLK5和Camp)和中性粒细胞相关基因在玫瑰痤疮样病变中的

表达水平。权利要求书1页 说明书9页 附图7页CN 110141563 A 2019.08.20

C N 110141563

A

权　利　要　求　书1/1页CN 110141563 A

1.一种改善玫瑰痤疮症状的药物，其特征在于，所述改善玫瑰痤疮症状的药物为氨甲环酸。

2.一种验证权利要求1所述改善玫瑰痤疮症状的药物药效的动物模型，其特征在于，所述改善玫瑰痤疮症状的药物的动物模型为7周龄BALB/C小鼠，用氨甲环酸治疗，每天灌胃对照缓冲溶液PBS和130mg每千克小鼠体重的氨甲环酸，连续七天，在最后2天皮下注射LL37多肽2次/天，以诱导玫瑰痤疮样皮肤损伤。

3.一种如权利要求2所述改善玫瑰痤疮症状的药物药效的细胞模型的构建方法，其特征在于，所述改善玫瑰痤疮症状的药物药效的细胞模型的构建方法包括：第一步，将HaCaT细胞培养在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的无钙基础培养基中，在37℃，5％的二氧化碳的培养箱中培养；HaCaT细胞达到90％融合度后，改用有钙培养基中培养，按照实验目的，分为空白组：不做任何处理，LL37组：LL37(4μM)刺激12h；TXA组：TXA(120mg/L)刺激12h；TXA+LL37组：TXA(120mg/L)刺激24h，于第12小时加入LL37(4μM)同时刺激12h；收集RNA，储存在-80℃直至分析；

第二步，人脐静脉内皮细胞在含有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的1640中培养，置于37℃，5％CO2的培养箱中；细胞用无血清基础培养基饥饿过夜，后与第一步处理相似，更换培基，且分组处理；空白组：不做任何处理；LL37组：LL37(4μM)刺激12h；TXA组：TXA(120mg/ L)刺激12h；TXA+LL37组：TXA(120mg/L)刺激24h，于第12小时加入LL37(4μM)同时刺激12h，后收集RNA，在-80℃保存直至分析。

4.如权利要求3所述的改善玫瑰痤疮症状的药物药效的动物模型的构建方法，其特征在于，所述改善玫瑰痤疮症状的药物药效的动物模型的构建方法还包括：

(1)组织学分析，用石蜡固定玫瑰痤疮样病变的全部皮肤，切成4μm厚；切片用苏木精和伊红染色染色，并且在标准光学显微镜下观察组织形态学；

(2)免疫荧光，在室温下用多聚甲醛固定8mm冷冻切片15分钟，并用5％正常驴血清和0.2％TritonX在室温下封闭持续1小时；将皮肤切片用抗CD4和抗CD31抗体在4℃下处理过夜，用Alexa Fluor 488标记的抗山羊IgG抗体常温染色1H，；使用Zeiss Axio Scope A1捕获图像；

(3)实时定量PCR分析，使用TRIzol试剂从细胞或皮肤损伤中分离总RNA；使用PrimeScript RT试剂盒将2μgRNA转录成cDNA，并在Applied Biosystems 7500机器上用iTaq Universal SYBR GREEN Supermix进行qPCR；

(4)统计分析，用GraphPad Prism6分析所有数据，并以平均值±SEM表示；Student's t 检验用于两组之间的比较差异。

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