自生固氮菌的分离鉴定

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自生固氮菌的分离鉴定

杨从发1,王淑军1,陈静1,许兴友2(1.淮海工学院食品工程系,江苏连云港,222005)

(2.淮海工学院化学工程系,江苏连云港,222005)

淮海工学院学报,1999,8(2)

摘要:从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到213个在无氮培养基上能良好生长的菌株,通过酶活测定,从中筛选得到18株固氮能力较强的菌株,并对其中酶活最高的4株菌株进行了鉴定,结果表明它们属于固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。

关键词:自生固氮菌;固氮酶;微生物肥料

0引言

微生物肥料的一些作用和生态效益是化学肥料所不具备的[1],施用微生物肥料,能提高土壤肥力,刺激作物生长和抑制有害微生物的活动,从而达到增产的目的[2]。此外,生产微生物肥料投资少,可利用农副产品就地取材。因而,微生物肥料的生产吸引了许多研究者的兴趣。本文报道从水稻、小麦、玉米和蔬菜等非豆科作物根际土壤中分离得到18株固氮能力较高的自生固氮菌,并对其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株进行了分类鉴定,结果表明它们属于固氮菌科的不同属。

1材料和方法

1.1菌种

采集水稻、小麦、玉米和蔬菜等农作物的根际土壤土样56个,从中分离获得213株在无氮培养基上能良好生长的菌株。

1.2分离培养基及分离方法

1.2.1富集培养基

蔗糖15g,磷酸二氢钾0.8g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,碳酸钙1g,质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL,水1000mL,pH为6.5~7.0,在250mL三角瓶中,每瓶分装30mL,灭菌备用。

1.2.2富集培养方法

取3~5g土样用50mL水制成混浊液,吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶中,100rpm,28℃,培养3~5天后,换新鲜培养基继续培养,重复4~5次后,稀释分离。

1.2.3平板分离培养基

在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基,灭菌后,倒入无菌培养皿中备用。

1.2.4分离方法

取富集培养后的培养液,稀释涂布平板分离培养基。28℃培养2天后,将在稀释度较大的平板上,生长较大的菌落移入斜面。培养后,保藏备用。

1.3固氮酶活性测定

1.3.1气相色谱法

参考文献[3]的方法,略加改变,将2mL乙炔气体冲入试管斜面内,塞上无菌橡皮塞,28℃,培养24h 后,用气相色谱仪测量固氮酶的活性,每种取4~5个重复,进样量100μL,按以下公式进行计算酶活。

EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

(μmol/h(斜面))

Se:乙烯峰面积;T:开氏绝对温度(T=273.13K)

Pe:实验条件下的大气压强(Pa);

Sb:乙炔峰面积;Te:实验条件下的温度(K);

P:绝对大气压强(P=101324.72Pa);

t=培养时间(t=24h)

1.3.2微量凯氏定氮法[4]用以下公式计算含氮量:

EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)

V1:样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

V2:空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

14:是1个毫克当量氮的毫克数;

V:发酵液样品毫升数。

2结果和讨论

2.1分离结果

从非豆科作物根际土壤中分离得到213个菌株,用气相色谱法和微量凯氏定氮法测定它们的固氮酶活性。结果发现,34株没有固氮能力(含氮量<1mg/L),161株有固氮能力(含氮量1~10mg/mL),18株固氮能力较强(含氮量>10mg/mL),其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌产酶能力最高。表1对固氮能力较强的18株菌株的酶活测定结果进行了统计。

表1:固氮酶活力测定结果(18株菌株)

表1中,EA1(μmol/h斜面)是用气相色谱法测定各菌株的试管斜面的固氮酶活性值。按以下公式计算:EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

虽然理论上,在固定条件下,乙炔还原活性与固氮酶对氮气的固定活性呈正相关,但在实际实验过程中,会由于斜面的新鲜程度,斜面培养基中的某些组成等原因,而影响实验结果的准确性,所以,每种菌都取5支对数生长期的斜面做重复试验,以尽量减少误差。EA2(mg/L)是将菌株接种到无氮培养液中,28℃,100rpm培养7天后,用微量凯氏定氮法测定最终发酵液的含氮量。按以下公式计算:EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)经回归分析[6],EA1与EA2呈强正直线相关(相关系数r=0.9527),回归方程为EA2=7.9560+0.5016×EA1,其结果与文献[3]的有关报道相似。

2.2鉴定结果

2.2.1形态特征见表2所示。

表2 形态特征

2.2.2生理生化特征见表3所示。

表3 生理生化特征

表4 褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷单孢菌模式种的特征[5]

2.2.3命名

根据以上形态和生理生化特征,参照[伯杰细菌鉴定手册](表4、表5列出了其中有关模式种的鉴别特征),将以上四株菌命名如下:

am65:与固氮菌科,氮单胞菌属的敏捷单胞菌相近,但甘露醇发酵及淀粉分解试验与模式种不同,暂定名为氮单胞菌am65(Azom onas sp.am65)。

bn72:与固氮菌科,固氮菌属的褐球固氮菌相同,定名为褐球固氮菌bn72(Azotobacter chroococ- cum bn72)。

cx58:为固氮菌科,拜叶林氏菌属。兼有弗来明拜叶林氏菌和运动拜叶林氏菌的部分特征,其种的特征还有待于进一步鉴定,暂定名为拜叶林氏菌cx58(Beijerinck ia sp.cx58)。

dy82:与固氮菌科,固氮菌属,拜氏固氮菌相同,定名为拜氏固氮菌dy82(Azotobacter beijerinckii dy82)。

表5拜叶林氏菌属内运动拜叶林氏菌和弗来明拜叶林氏菌的特征[5]

注:+:少数细胞,绝大多数在幼龄时期; *:数字是代表在培养基上生长的菌株的百分数;

+(-):大约所测定菌株的40%~50%为阳性; ++:生长好; -/W:反应阴性或弱。

参考文献:

[1]陈廷伟,葛诚.我国微生物肥料发展趋向[J].土壤肥料,1995,(6):16~20.

[2]李元芳.有效活菌数的测定方法允许差与判定[J].土壤肥料,1997,(4):43~44.

[3]程萍.固氮菌肥料生产菌株的酶活性测定[J].土壤肥料,1995,(1):44~46.

[4]无锡轻工业学院等合编.食品分析[M].北京:轻工业出版社,1991.216~219.

[5]布坎南RE,吉本斯NE等.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版.北京:科学出版社,1984.12.

[6]潘维栋.数据统计方法[M].上海:教育出版社,1984.8.

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