结肠炎模型建立及评价
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溃疡性结肠炎动物模型建立、评价溃疡性结肠炎( Ulcerative Colitis) 又称非特异性溃疡性结肠炎,是一种病因不明的大肠黏膜的慢性炎症和溃疡性病变。主要临床表现有腹痛,腹泻、粘液脓血便、里急后重等。病程长,常反复发作,迁延不愈,发作期与缓解期交替,较难治愈。病变主要累及直肠和乙状结肠,严重者可侵犯全部结肠甚至回肠末端,其病理特点是结肠黏膜广泛溃疡形成。溃疡性结肠炎发病可能与感染、遗传及免疫等因素有关。[1]
建立理想的动物模型对于阐明该病的病因、病变发展规律以及有效的防治有重要意义。利用动物模型实验,可以免去对人体的伤害;可以严格控制条件,排除各种干扰;提高复制的成功率和缩短病程,便于实验的多次重复;便于实验样品的全面采集。动物模型固然有其优越性,可是毕竟这是一种带有模拟性质的间接实验,得出的结论具有局限性。
关键词:溃疡性结肠炎;动物模型;病理
动物模型具有UC动物模型的制备方法, 大致可分为四类:免疫诱发法,化学损伤法,复合法,中医证型造模法。
1.免疫造模法
张晓峰等[2]取家免或人新鲜结肠黏膜组织,加入完全弗氏佐剂,制成抗原乳剂,首次于大鼠足跖注射抗原乳剂0.4ml(含抗原4mg),第10、17、24、31天时分别于大鼠不同部位皮下注射抗原乳剂0.8ml(含抗原8mg),第31天不加佐剂灌肠。予抗原4mg。上述处理结束后第2天, 大鼠出现黏液血便, 精神萎靡。病变黏膜可见炎症、溃疡形成, 促炎细胞因子IL- l、IL- 6、TNF及其mRNA 表达增强, 免疫球蛋白也发生与人UC相似的变化[3]。该模型的特点是病变持续时间较长,与人UC的免疫发病机制和病理变化均较接近, 但造模过程较繁琐, 周期较长,掌握困难,重复性不理想。
黄永年等[4]取牛结肠黏膜蛋白与完全弗氏佐剂( 1: 1)制成完全抗原,大鼠首次足跖内注射抗原4mg/只,于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg/只,最后1次注射不加佐,至血清抗结肠抗体达到作用有效量、第35天用20g/L的甲醛溶液1.5 ml灌肠, 留置1用生理盐水洗净后排去,再用抗原液( 4 g /L,不加佐剂)2 ml灌肠,置2 h, 3d 后处死大鼠, 取其结肠标本,病理检查有充血、水肿、炎细胞浸润和溃疡形成等。
2.化学损伤法
2.1 乙酸造模法: Cetinkaya A[5]将乙酸注入大鼠结肠,然后以0.9% NaCl溶液冲洗2次。造模后大鼠出现腹泻、血便,第3天病变达高峰期,病变以远端结肠为主,多在1周内消失。该模型的不足之处在于结肠炎症以急性单纯性黏膜炎症为主,病情进展和愈合迅速。目前主要用于UC急性炎症发作期药物治疗的疗效观察和评价黏膜愈合机制。
2.2角叉菜胶造模法: 大鼠自由饮用3%角叉菜胶溶液2周后出现UC症状,3周后肉眼可见盲肠、结肠、直肠出现针尖大小的溃疡和出血点。组织学可见隐窝脓肿、变形,黏膜溃疡形成, 黏膜和黏膜下层炎性细胞渗出。该模型的特点是病变局限于结直肠,造模过程中粪便含菌量升高。该模型的优点是持续时间长,急性期3-6周, 持续6-8周,停止饮用角叉菜胶后炎症持续1-2周。缺点是模型动物多用豚鼠,成本较高,周期较长。
2.3葡聚糖硫酸钠(DSS): BALB/c小鼠自由饮用5%DSS溶液5天,造成急性UC模型。急性模型表现为体重下降、腹泻、血便,溃疡多出现于远端结肠。产生的细胞因子主要为白细胞介素(IL)-12、干扰素(IFN)、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)等。机制可能与巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调和DSS的负电荷影响结肠上皮DNA 合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障
有关[6]。该模型与人UC相似, 且可反复以DSS刺激, 产生类似于人UC急性期和缓解期的变化, 广泛应用于UC 的病理机制和筛选对UC有治疗潜力的药物。
2.4过氧化亚硝酸钠(NaOONO2) 造模法:大鼠结肠内注入0.5ml不同浓度的过氧化硝酸钠,1周后处死大鼠,光镜下可见黏膜损伤较严重,明显充血水肿,有多个溃疡,肠腔变狭,镜下溃疡较深,肠壁大量中性粒细胞浸润。该模型制作简单、重复性好、成本低, 其形态学改变与氮氧化机制有关,能反映UC发病的部分本质[7]。该模型较适用于研究抗UC药物在抗氧化和调控一氧化氮(NO)作用机制方面的研究。
2.5 2,4 6- 三硝基苯磺酸(TNBS)造模法:TNBS与蛋白结合成抗原,引起免疫反应,诱导肠炎发生。郑礼[8]将不同剂量浓度TNBS推入结肠,3周后处死,取结肠进行肉眼和组织学观察,镜下见黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润,以中性粒细胞浸润为主,部分出现上皮脱落和黏膜层坏死,但肌层仍然完整。TNBS模型制作简单、重复性好、价廉、病变持续时间长、慢性炎症表现突出,为研究炎症慢性化及探索药物治疗创造了条件。朱代华等[9]用2, 4- 二硝基苯磺酸( DNBS) /乙醇也成功复制该模型,可用于UC免疫学方面的研究。
2.6二硝基氯苯(DNCB)造模法: DNCB与组织蛋白结合可激发细胞免疫反应。如多次接触动物可对之产生过敏反应。Bicks用DNCB反复接触豚鼠皮肤,再用DNCB灌肠,1 d后结肠黏膜即出现以溃疡为主的炎症反应。夏冰等[10]应用此法成功地使豚鼠产生UC,并在黏膜下层发现大量中性粒细胞、淋巴细胞及其它炎性细胞浸润。结果提示细胞免疫反应在溃疡性结肠炎的发病机制中占有重要地位,为探讨溃疡性结肠炎的病因与发病机理提供了实验依据。
3.复合造模法
3.1化学法及束缚法复合造模法:谷松等[11]选用雄性Wistar大白鼠,将大鼠四肢不定时捆绑,限制其自由活动1周,大鼠禁食24h(不禁水),麻醉后将TNBS/乙醇液0.25 ml由肛门注入肠腔内。UC造模成功后每日仍持续束缚,第3周末处死大鼠。UC造模后的第2天即出现稀便,随后相继出现黏液便、脓血便,伴有饮食减少、消瘦、拱背、竖毛、毛不光洁,有拖尾现象。造模后第3天,肠管黏膜可见坏死组织、溃疡及糜烂面,其附近黏膜充血、水肿明显;造模后第3周末,肠管狭小,肠壁增厚,黏膜可见多个溃疡,溃疡旁黏膜充血、水肿明显。造模后第3天病理形态学观察,可见黏膜层大片缺失,黏膜下层有大量炎性细胞浸润,同时可见溃疡灶,并见水肿、出血和急性血管炎;第3周末,可见结肠黏膜水肿、充血、隐窝炎及溃疡灶,黏膜下明显水肿,可见大量炎性细胞浸润,呈现慢性炎症特征。
3.2限食限动加醋酸结肠内注射法:顾立刚等[12]将大鼠放入特制圆形箱内限制活动、限制饮食,并用胶布束绑后肢,每天约8h,连续3周造成肝郁脾虚证,然后用5%醋酸1mL注入结肠,诱导结肠溃疡,连续3周。结果显示,模型组大鼠体重下降、粪便溏泄明显,免疫器官萎缩,免疫功能下降,结肠黏膜充血水肿明显,出现严重糜烂,溃疡表面布满脓苔,结肠黏膜溃疡指数增加,甚至出现结肠穿孔。说明中医肝郁因素或西医学所称的精神刺激因素的加入,可通过影响炎症的过程和活动性,从而加重溃疡性结肠炎的病变。
3.3免疫法加醋酸肠内注射造模法:吴玉泓等[13]选用SPF级Wistar大鼠造模,取5只家兔的新鲜结肠黏膜层,制成黏膜匀浆,加入完全福氏佐剂,首次足跖内注射抗原2 mg,于第1、14、21、28天分别于足跖内注射抗原2mg。并在造模第21、28天,向大鼠肛门内注入5%
醋酸1mL,再生理盐水灌胃2周。在灌肠后第1周时即见到结肠黏膜糜烂、溃疡,大部分黏膜