结肠炎模型建立及评价

溃疡性结肠炎动物模型建立、评价溃疡性结肠炎( Ulcerative Colitis) 又称非特异性溃疡性结肠炎,是一种病因不明的大肠黏膜的慢性炎症和溃疡性病变。主要临床表现有腹痛，腹泻、粘液脓血便、里急后重等。病程长，常反复发作，迁延不愈，发作期与缓解期交替，较难治愈。病变主要累及直肠和乙状结肠，严重者可侵犯全部结肠甚至回肠末端，其病理特点是结肠黏膜广泛溃疡形成。溃疡性结肠炎发病可能与感染、遗传及免疫等因素有关。[1]

建立理想的动物模型对于阐明该病的病因、病变发展规律以及有效的防治有重要意义。利用动物模型实验，可以免去对人体的伤害；可以严格控制条件，排除各种干扰；提高复制的成功率和缩短病程，便于实验的多次重复；便于实验样品的全面采集。动物模型固然有其优越性，可是毕竟这是一种带有模拟性质的间接实验，得出的结论具有局限性。

关键词：溃疡性结肠炎；动物模型；病理

动物模型具有UC动物模型的制备方法, 大致可分为四类：免疫诱发法，化学损伤法，复合法，中医证型造模法。

1.免疫造模法

张晓峰等[2]取家免或人新鲜结肠黏膜组织，加入完全弗氏佐剂，制成抗原乳剂，首次于大鼠足跖注射抗原乳剂0.4ml（含抗原4mg），第10、17、24、31天时分别于大鼠不同部位皮下注射抗原乳剂0.8ml（含抗原8mg），第31天不加佐剂灌肠。予抗原4mg。上述处理结束后第2天, 大鼠出现黏液血便, 精神萎靡。病变黏膜可见炎症、溃疡形成, 促炎细胞因子IL- l、IL- 6、TNF及其mRNA 表达增强, 免疫球蛋白也发生与人UC相似的变化[3]。该模型的特点是病变持续时间较长，与人UC的免疫发病机制和病理变化均较接近, 但造模过程较繁琐, 周期较长，掌握困难，重复性不理想。

黄永年等[4]取牛结肠黏膜蛋白与完全弗氏佐剂( 1: 1)制成完全抗原，大鼠首次足跖内注射抗原4mg/只,于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg/只，最后1次注射不加佐，至血清抗结肠抗体达到作用有效量、第35天用20g/L的甲醛溶液1.5 ml灌肠, 留置1用生理盐水洗净后排去，再用抗原液( 4 g /L,不加佐剂)2 ml灌肠，置2 h, 3d 后处死大鼠, 取其结肠标本，病理检查有充血、水肿、炎细胞浸润和溃疡形成等。

2.化学损伤法

2.1 乙酸造模法: Cetinkaya A[5]将乙酸注入大鼠结肠，然后以0.9% NaCl溶液冲洗2次。造模后大鼠出现腹泻、血便，第3天病变达高峰期，病变以远端结肠为主，多在1周内消失。该模型的不足之处在于结肠炎症以急性单纯性黏膜炎症为主，病情进展和愈合迅速。目前主要用于UC急性炎症发作期药物治疗的疗效观察和评价黏膜愈合机制。

2.2角叉菜胶造模法: 大鼠自由饮用3%角叉菜胶溶液2周后出现UC症状，3周后肉眼可见盲肠、结肠、直肠出现针尖大小的溃疡和出血点。组织学可见隐窝脓肿、变形，黏膜溃疡形成, 黏膜和黏膜下层炎性细胞渗出。该模型的特点是病变局限于结直肠，造模过程中粪便含菌量升高。该模型的优点是持续时间长，急性期3-6周, 持续6-8周，停止饮用角叉菜胶后炎症持续1-2周。缺点是模型动物多用豚鼠，成本较高，周期较长。

2.3葡聚糖硫酸钠(DSS): BALB/c小鼠自由饮用5%DSS溶液5天，造成急性UC模型。急性模型表现为体重下降、腹泻、血便，溃疡多出现于远端结肠。产生的细胞因子主要为白细胞介素(IL)-12、干扰素(IFN)、IL-1、肿瘤坏死因子(TNF)等。机制可能与巨噬细胞功能失调、肠道菌群失调和DSS的负电荷影响结肠上皮DNA 合成、抑制上皮细胞增生、破坏肠黏膜屏障

有关[6]。该模型与人UC相似, 且可反复以DSS刺激, 产生类似于人UC急性期和缓解期的变化, 广泛应用于UC 的病理机制和筛选对UC有治疗潜力的药物。

2.4过氧化亚硝酸钠(NaOONO2) 造模法：大鼠结肠内注入0.5ml不同浓度的过氧化硝酸钠，1周后处死大鼠，光镜下可见黏膜损伤较严重，明显充血水肿，有多个溃疡，肠腔变狭，镜下溃疡较深，肠壁大量中性粒细胞浸润。该模型制作简单、重复性好、成本低, 其形态学改变与氮氧化机制有关，能反映UC发病的部分本质[7]。该模型较适用于研究抗UC药物在抗氧化和调控一氧化氮(NO)作用机制方面的研究。

2.5 2,4 6- 三硝基苯磺酸(TNBS)造模法：TNBS与蛋白结合成抗原，引起免疫反应，诱导肠炎发生。郑礼[8]将不同剂量浓度TNBS推入结肠，3周后处死，取结肠进行肉眼和组织学观察，镜下见黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润，以中性粒细胞浸润为主，部分出现上皮脱落和黏膜层坏死，但肌层仍然完整。TNBS模型制作简单、重复性好、价廉、病变持续时间长、慢性炎症表现突出，为研究炎症慢性化及探索药物治疗创造了条件。朱代华等[9]用2, 4- 二硝基苯磺酸( DNBS) /乙醇也成功复制该模型，可用于UC免疫学方面的研究。

2.6二硝基氯苯(DNCB)造模法: DNCB与组织蛋白结合可激发细胞免疫反应。如多次接触动物可对之产生过敏反应。Bicks用DNCB反复接触豚鼠皮肤，再用DNCB灌肠，1 d后结肠黏膜即出现以溃疡为主的炎症反应。夏冰等[10]应用此法成功地使豚鼠产生UC，并在黏膜下层发现大量中性粒细胞、淋巴细胞及其它炎性细胞浸润。结果提示细胞免疫反应在溃疡性结肠炎的发病机制中占有重要地位，为探讨溃疡性结肠炎的病因与发病机理提供了实验依据。

3．复合造模法

3.1化学法及束缚法复合造模法：谷松等[11]选用雄性Wistar大白鼠，将大鼠四肢不定时捆绑，限制其自由活动1周，大鼠禁食24h(不禁水)，麻醉后将TNBS/乙醇液0.25 ml由肛门注入肠腔内。UC造模成功后每日仍持续束缚，第3周末处死大鼠。UC造模后的第2天即出现稀便，随后相继出现黏液便、脓血便，伴有饮食减少、消瘦、拱背、竖毛、毛不光洁，有拖尾现象。造模后第3天，肠管黏膜可见坏死组织、溃疡及糜烂面，其附近黏膜充血、水肿明显；造模后第3周末，肠管狭小，肠壁增厚，黏膜可见多个溃疡，溃疡旁黏膜充血、水肿明显。造模后第3天病理形态学观察，可见黏膜层大片缺失，黏膜下层有大量炎性细胞浸润，同时可见溃疡灶，并见水肿、出血和急性血管炎；第3周末，可见结肠黏膜水肿、充血、隐窝炎及溃疡灶，黏膜下明显水肿，可见大量炎性细胞浸润，呈现慢性炎症特征。

3.2限食限动加醋酸结肠内注射法：顾立刚等[12]将大鼠放入特制圆形箱内限制活动、限制饮食，并用胶布束绑后肢，每天约8h，连续3周造成肝郁脾虚证，然后用5%醋酸1mL注入结肠，诱导结肠溃疡，连续3周。结果显示，模型组大鼠体重下降、粪便溏泄明显，免疫器官萎缩，免疫功能下降，结肠黏膜充血水肿明显，出现严重糜烂，溃疡表面布满脓苔，结肠黏膜溃疡指数增加，甚至出现结肠穿孔。说明中医肝郁因素或西医学所称的精神刺激因素的加入，可通过影响炎症的过程和活动性，从而加重溃疡性结肠炎的病变。

3.3免疫法加醋酸肠内注射造模法：吴玉泓等[13]选用SPF级Wistar大鼠造模，取5只家兔的新鲜结肠黏膜层，制成黏膜匀浆，加入完全福氏佐剂，首次足跖内注射抗原2 mg，于第1、14、21、28天分别于足跖内注射抗原2mg。并在造模第21、28天，向大鼠肛门内注入5%

醋酸1mL，再生理盐水灌胃2周。在灌肠后第1周时即见到结肠黏膜糜烂、溃疡，大部分黏膜

缺损，有的形成深大溃疡，黏膜腺体破坏，黏膜及黏膜下大量炎性细胞浸润，淋巴细胞散在分布，黏膜层变薄，黏膜下固有层局部充血、水肿、纤维增生，到本实验结束黏膜仍呈中度或重度炎症，仍有单个或多处陈旧性溃疡，基底隐窝部分破坏，上皮部分破坏持续，第1～第3周时结肠组织学评分、结肠TNF-α的表达、血清IL-6含量均升高明显，与第2、第3、第4 组之间的差异均有统计学意义，与人类UC发生的免疫学机制极其相似，又符合其肠道炎症发作期的特点。

3.4 二硝基氯苯-醋酸复合法：脱去大鼠背部被毛，每天在鼠背部滴2%二硝基氯苯（DNCB）-丙酮（DNCB 2g/100ml）1次，每次每只5滴（约0.3ml），连续14天；第15天用直径3mm的导尿管经肛门向肠管内插入8cm，注入0.1%（0.04mol/L）DNCB酒精液（DNCB1g/50%酒精1000ml）0.25ml；第16天再次灌肠给予8%醋酸2ml，准确定时15s后，用5ml生理盐水冲洗。造模后1-2周，动物表现精神萎靡，体重下降，活动减少，毛发色泽暗淡，食量减少，大便溏稀或黏液血便等症状，可持续16周以上，并出现典型的溃疡性结肠炎病理改变。2-5周后转为慢性表现，溃疡愈合，但慢性炎症持续存在。本模型操作简便，造模成功率高，重复性好，病程较长，病理改变与人类相似。作为免疫诱发模型，克服了单独用二硝酸氯苯法病程短、自愈性强的缺点，也克服了酒精法缺少免疫反应的不足，是一种较理想的模型。[1]

4.中医证型造模法：中医认为溃疡性结肠炎是脾失运化，湿聚瘀阻所致，临床常见肝郁脾虚型和脾虚型。

4.1 肝郁脾虚型动物模型(精神刺激造模法)：戴芳等[14]将实验用雄性SD大鼠的尾巴用塑料夹夹住，让其相互撕咬、打斗，若停止打斗，则用小铁丝对其予以刺激，让其重新打斗或奔跑，每日处理1次，30min /次。隔日禁食，禁食时将饲料用透明塑料袋悬挂在笼子上方, 让大鼠可以看到但又无法吃到饲料。随着造模天数的增加，造模组大鼠情绪由稳定变为易怒继而低落，行为状态变为倦卧少动、扎堆、不活跃、反应迟缓，睡眠状态变为倦卧、嗜睡，大便由正常变为稍干至便溏，毛发变为不泽、枯乱，饮食逐渐减少，叫声逐渐变细，体质量逐渐减轻。实验进行到第15天时，造模组大鼠的活动明显减少、扎堆、倦卧、嗜睡、拱背、叫声细、纳少、毛发枯乱不泽、淡漠、对外界刺激不兴奋、体重减轻等肝郁脾虚表现。韩秋艳[15] 每天限制大鼠一定时间的活动，并束绑后肢3周后，用5%乙酸灌注大鼠结肠或用慢性夹尾激怒加高浓度大黄灌胃法造成溃疡性结肠炎肝郁脾虚证模型。大鼠分别在3、6和12d后处死。结果表明，模型组大鼠体重下降、粪便溏泄、肾上腺重量增加、胸腺重量下降，结肠黏膜在光镜下可见到大量炎细胞浸润、出血、水肿和溃疡等。该实验时间较长，较繁琐。

4.2 脾虚型动物模型

4.2.1 饮食不节复制的脾虚证动物模型：王晓明等[16]根据饮食不节, 劳倦过度导致脾气虚证的理论，单日喂饲甘蓝10-15只，滚带式跑步机快跑5min/只(频率60圈/min)，双日猪油脂2mL+生理盐水2mL/只灌胃。18天后，出现体重下降、倦怠、懒动，肛温及阴囊温度正常或下降不明显，粪便不正常(时软，时溏，时干)。

4.2.2药物复制的脾虚模型：王晓洁等[17]选Wista r大鼠禁食不禁水12 h，雌雄各半。灌服番泻叶浸剂，1次/d，灌服3d后，禁食不禁水35h，麻醉后用0.5%肥皂水2mL/只灌肠冲洗；动物苏醒后，正常饲养。从次日开始，继续灌服番泻叶浸剂2d，造模第8d禁食不禁水12h，称重处死，取肠段进行肉眼观察病理切片显微镜下观察，出现溃疡。王玉良等[18]选用健康豚鼠，禁食不禁水17h，按1.5mL /100 g体重的容积灌服番泻叶浸剂；每天l次，灌服3天后，禁食不禁水36 h，麻醉后0.5%肥皂水灌肠。20min后肛门注入5%冰乙酸0.1mL。次日开始灌服番泻叶2天。在灌服番泻叶3天后陆续出现便溏、纳呆、消瘦、畏寒、拱背、懒动、失光泽、

精神萎靡等脾虚症状，自肛门注入冰乙酸后2-3天出现黏液便，有的带血性分泌物。造模第8天处死动物，取出结肠段切开，可见肠黏膜水肿，不同大小的溃疡灶。病理切片可见黏膜、黏膜下层水肿、充血，大量炎性细胞浸润，黏膜上皮脱落，溃疡形成。

目前，肠道细菌被认为可能是参与UC的始动和持续因素，肠道细菌及其产物能刺激肠黏膜免疫系统，诱发具有遗传易感性人群肠黏膜免疫系统的功能紊乱，产生异常的免疫反应，导致UC发病[19]。发生UC时，由肠道菌群产生的脂多糖可直接活化黏膜固有层的吞噬细胞，使其增生，进而释放TNF-α、IL-6等一系列细胞因子，破坏肠黏膜屏障，同时血管系统也遭到破坏，导致一系列UC典型的炎症病变[20-22]。Sharon等[23]经研究认为，大鼠乙酸性结肠模型用乙酸直接刺激造成大鼠结肠黏膜及血管的直接损伤作用，类似人类肠道急性炎症发作期，但其早期黏膜损伤的非特异性、缺乏慢性期以及易受个体差异（肠道的耐受性不同）的影响系其缺点。黄永年[24]等采用大鼠的正常菌群大肠杆菌为抗原，认为其比较接近于上述UC的发病机制，但缺点是实验周期长。这些都说明大肠杆菌加乙酸法复制的动物模型与人UC的临床症状、病程变化、病理学改变，及炎症递质改变相似，操作简单，是理想的UC动物模型。

运用溃疡性结肠炎动物模型是研究人类溃疡性结肠炎的有效手段，动物模型能够帮助我们探索疾病的病因，发病机制，病程变化，防治技术和防治药物及药物作用机制。在研究和制作疾病动物模型的过程中，应当尽可能强化、纯化、简化实验条件，以便缩短发病时间和提高发病率。关于中医理论下的疾病动物模型的复制，由于中西医之间的差异，很可能还不尽完善，这需要我们进一步积极地探索，希望我们研究工作者能够复制出理想的动物模型。

参考文献：

[1]李才人类疾病动物模型的复制北京：人民卫生出版社，2008，7：282

[2]张晓峰,苏佩清,任建素等中药清肠栓对溃疡性结肠炎大鼠实验模型的影响[J] 河北医学, 1998,4(5) : 1- 3

[3]李成文现代免疫化学技术[M] 上海: 上海科学技术出版社，1992: 185- 187

[4]黄永年,张元德,邢玉馥大鼠溃疡性结肠炎模型的建立与观察[J] 中华病理学杂志,1995, 24(6): 392

[5] Cetinkaya A, Bulbuloglu E, Kurutas EB, et al Beneficial effects of N- acety lcysteine on acetic acidinduced colitis in rats[J] Tohoku J ExpMed, 2005(206): 131-139

[6] OkayamaM, T subouchiR, NishioH, et al Protective effect of intrarectal adm in istration of rebamipideon dextran sulfate sodium-induced rat colitis[J] Digest ion,2005( 70):240-249

[7]郑红斌，胡鸿毅，黄礼杰，等不同剂量过氧化亚硝酸钠诱导大鼠溃疡性结肠炎的实验研究[J] 浙江中医学院学报,2001,25(4):39-40

[8]郑礼大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J] 中国药理学报, 1998,14(4):370

[9]朱代华，张兴明，郭丹二硝基苯磺酸诱导的核实鼠溃疡性结肠炎动物模型[J] 重庆医科大学学报，2004，29(4):486

[10]夏冰，黄梅芳，付苓等细胞免疫反应性溃疡性结肠炎模型[J] 中华实验外科杂志, 1992，9(3): 130

[11]谷松，关庆增，明彩荣等溃疡性结肠炎肝郁大鼠模型的实验研究[J] 辽宁中医杂志，2005，32(11)：1210-1211

[12]顾立刚，郭学志，王庆国大鼠溃疡性结肠炎肝郁脾虚证模型的研究[J] 北京中医药大学学报，1999，22(2)：21-23

[13]吴玉泓，李海龙，段永强等免疫致敏结合局部乙酸刺激法建立大鼠溃疡性结肠炎模型[J] 中国实验动物学报，2010，18(1)：65-68

[14]戴芳，唐亚平，龚超奇等肝郁脾虚证大鼠模型的研制[J] 甘肃中医，2009，22(10): 69-70

[15]韩秋艳肝郁脾虚证动物模型的建立[J] 贵阳中医学院学报，2001，23(3)：59-62

[16]王晓明，易杰，廖世新等脾虚证动物模型的客观评估[J] 中华中医药杂志，2006，21(7)：406-408

[17]王晓洁，梁建光，万军利等建立大鼠脾虚型溃疡性结肠炎病理模型的实验[J] 烟台师范学院学报(自然科学版),1999,15(2)：151-154

[18]王玉良，谢杰，李显华等固本益肠片治疗实验性豚鼠脾虚型溃疡性结肠炎的研究[J] 中国中西医结合杂志,1995,15(2):98-100

[19]白爱平.炎性肠病发病机制的微生物学因素[J].世界华人消化志,2006,14(7):654-649.

[20]庞艳华,郝建宇,关玉盘等．溃疡性结肠炎患者TH1类细胞因子的表达[J].世界华人消化杂志,2007,15(14):1665-1667.

[21] Reddy KP, Markowitz JE, Ruchelli ED, et al . Lamina propria and circulating inter leukin-8 in newly and previously diagnosed pediatric inflammatory bowel disease patients[J].Dig Dis Sci,2007,52(2):365-372.

[22] Schinzari F, Armuzzi A, De Pascalis B,et al.Tumor necrosis factor-alpha antagonism improves endothelial dysfunction in patients with Crohn’s disease[J]. Clin Pharmacol Ther,2008,83(1):70-76.

[23] Sharon P, Stenson WF. Metabolism of arachidonic acid inacetic acid colitis in rats [J]. Gastroenterology,1985,88(1):55-63.

[24] 黄永年，张元德，邢玉馥等大鼠溃疡性结肠炎模型的建立与观察[J].白求恩医科大学学报,1995,21(4):357-359.