基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶
【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体
Effects of matrix metalloproteinase9 on the expression of tumor necrosis factor receptorl in human colon carcinoma cell lines 【Abstract】 AIM: To study the effects of matrix metalloproteinase9 (MMP9) on the expression of tumor necrosis factor receptorl (TNFRl) and migratory and invasive potentials in human
colon carcinoma cells. METHODS: Immunofluorescence staining was applied to examine the expression of TNFRl in SW1116 in human colon carcinoma cell lines. The expression of TNFRl was assayed by flow cytometry in human colon carcinoma SW1116 cells treated with iMMP9 at different concentrations and at different time periods of culture. RESULTS: TNFRl was expressed in SW1116 cells and MMP9 downregulated the expression of TNFRl on cell surface in a dose and timedependent manner. CONCLUSION: MMP9 decreases the expression of TNFRl on the surface of human colon carcinoma cells, which may be a factor associated with invasive and metastasis potentials of colon carcinoma.
【Keywords】 intestinal neoplasms; matrix
metalloproteinase; TNFR
【摘要】目的：研究基质金属蛋白酶9 (MMP9)对大肠癌细胞肿瘤坏死
因子受体1 (TNFRl)表达的影响以及促进大肠癌侵袭和转移的可能途径.方法:
通过免疫荧光法研究TNFRl在大肠癌细胞SW1116中的表达；用MMP9干预培养
的大肠癌SW1116细胞，用流式细胞术检测MMP9不同剂量和不同作用时间时
TNFRl表达变化.结果：①SW1116细胞表达TNFR1; @關?9对3化1116细胞表面TNFRl表达有下调作用，但有剂量和时间依赖性.结论：題?9下调大肠癌细胞
表面TNFRl的表达，可能与大肠癌侵袭转移密切相关.
【关键词】肠肿瘤；基质金属蛋白酶；肿瘤坏死因子受体
0引言
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, 了即)是一种主要由单核巨隨细胞产生的多肽细胞因子，因其在内毒素处理后具有杀伤肿瘤细胞的作用而被命名为肿瘤坏死因子.TNF的生物学活性是通过存在于细胞表面的膜受体，即肿瘤坏死因子受体1(如0^«: necrosis factor receptor 1，1即81)和肿瘤坏死因子受体2(1腿0^: necrosis factor receptor 2，丁即1?2)介导.体内外实验已证实肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR)介导肿瘤坏死因子的肿瘤杀伤作用，体内有多种免疫活性因子（干扰素、白介素等）即通过激活上调TNFR以达到清除肿瘤的目的[1 ]，因而诱导并稳定肿瘤细胞膜TNFR对机体抗肿瘤起非常重要的作用.其他研究还证实大肠癌组织中存在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMPs)高表达或活性增强现象.某些活性基质金属蛋白酶可能通过酶解作用促进肿瘤细胞膜TNFR的释放形成高水平的可溶性肿瘤坏死因子受体[2] (soluble tumor necrosis factor receptor, sTNFR),是肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要方式.本研究通过检测1~?“在肿瘤细胞膜的表达及NMP9对肿瘤细胞膜TNFRl表达的影响，探讨MMP9通过调节TNFRl促进大肠癌转移的可能机制.
1材料和方法
1. 1材料
大肠癌细胞株（SW1116)由南方医院消化科实验室保存；小牛血清（杭州四季青生物制品研究所）；RPMI1640培养液，青、链双抗，2.5 8几胰酶丑0 TA (广州威佳生物试剂公司）；鼠抗人了即81单克隆抗体（SantaCruz&
司）；FITC标记的羊抗鼠二抗（武汉博士德公司）；荧光素异硫氰酸盐（FITC)
标记的鼠抗人TNFRl单克隆抗体及重组人MP9购自美国R&D公司；FITC标记
的鼠化01对照抗体（北京鼎国生物有限公司）.
1.2主要仪器倒置、相差显微镜（01ympas&3) •’流式细胞仪（BECTON DICKINS0N&3).
1.3方法
1. 3. 1细胞培养大肠癌SW1116细胞株为贴壁生长细胞.用RPMI1640培养基于25现2培养瓶，在371，饱和湿度、50 mL/L 002培养箱中培养，培养基中含100 mL/L小牛血清，青、链霉素各100 U/mL.汇片后弃培养液，用
2. 5 g/L 胰酶丑D T入消化细胞.细胞接种于25 cm2培养瓶，每3 d传代一次.
1.3.2细胞爬片及免疫荧光染色SW1116细胞用
2.5 §/1胰蛋白酶消化，用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液将细胞调成5父104/‘的细胞悬液，接种子24孔板中，每孔预先置入 6 mmX6 mm盖玻片一张，待细胞生长状态良好时终止培养.4 8几多聚甲醛固定爬片30化11后0.1 mL/L ?85冲洗，用10 mL/L Triton 乂100处理15 “11后正常羊血清37°0：孵育30 min,甩去血清.滴加 1 : 50稀释的鼠抗人TNFR1单克隆抗体，41湿盒过夜后滴加 1 : 100稀释的?11^标记的羊抗鼠二抗，371：孵育 1 h，用蒸馏水振洗后无荧光缓冲甘油封片. 阴性对照用？65代替一抗进行染色.TNFRl阳性表达细胞在荧光显微镜下发出
绿色荧光.
1. 3. 3干预实验人SW1116大肠癌细胞以2父105/虬接种于24孔板，用含
100虬几小牛血清即^01640培养基在371，50 mL/L 002培养箱中培养12 h
使细胞吸附在培养板上换用无血清培养基继续培养24 h后加入MMP9进行干预，
分组如下：®MMP9 0 ng/mL (八组）；@MMP9 154 ng/mL ⑶组）；@NMP9 385
ng/raL (0组）；@MMP9 770 ng/mL (0组）；©MMP9 1155 ng/mL 化组），干
预3 h;然后在MMP9为770 ng/mL的浓度下，分别作用0，1. 5，3，6和9 h.
1. 3. 4流式细胞仪检测大肠癌SW1116细胞TNFRl的表达采用直接免疫荧光标记法培养细胞制成单细胞悬液并计数，实验管取20 M匕单细胞悬液（含1父105细胞）与10 M L「11^标记的鼠抗人1斯“单克隆抗体，对照管加入相应无关鼠对照单抗10 M [在41共育45 min,用含 5 g/L 834的等渗？83缓冲液洗涤细胞两次后弃上清，然后加入400 M L 4 §几的多聚甲醛于41固定30 min,即上机检测.每份样品测定10 000个细胞，计算细胞表达1~?^的百分率.
统计学处理：各实验独立重复3次，应用3?33 10.0统计软件.数据用
叉土5表示，采用单因素方差分析和0仙阳《1检验的两两比较，？<0.05为有统
计学差异.
2结果
2. 1免疫荧光染色结果TNFRl在SW1116细胞膜呈较强荧光，对照组无表达(图1).々：5化1116细胞；8:阴性对照.
图ITNFRl在SW1116细胞的表达
2.2不同浓度》
9作用后对TNFRl表达的影响流式细胞检测结果显示，在不同的浓度作用3
h后，与MMP9 0 ng/mL组(表达率90. 92%)比较，MMP9 770 ng/mL组（表达率
69.96%)，MMP9 1155叩/0^组(表达率65.06%) 1即”表达水平明显降低
(P<0. 05) ； MMP9 154 叫/此组（表达率85.05%)，MMP9 385 叩/此组(表达
率87.54%)与響9 0叩/此组相似（P>0.05) ； MMP9 154叩/乩组与國^
385叩/虬组1册81表达水平明显高于腿?9 770 ng/nd^PMMP9 1155 ng/mLS
(P<0. 05) ； MMP9 154叩/虬组与題?9 385邶/虬组1邢町表达水平相似
(P>0. 05) ； MMP9 770叩/虬组和題?9 1155叩/虬间了陬町表达水平相似
(P>0.05,图2).
2. 2MMP
9作用不同时间后对1即^表达的影响在—9 770 1^/仏浓度，不同作用时间条件下，与0 h m(表达率86.36%)比较，3 h (表达率67.68%)，6 h (表达率18.08%)，9 h (表达率14.38%)组TNFRl水平明显降低（P<0.05)；
1.5 h (表达率83.88%)组与0匕组1呢幻水平相似（P>0.05) ； 3 hSTNFRl 水平明显高于 6 11和9匕组（P<0.05) ； 6 &组与9 &组1见^1水平相似(P>0. 05,图3). aP<0. 05 vs A.
3讨论
TNF在体内外对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，人们曾对TNF治疗肿瘤寄予
很大希望.但由于它在治
疗肿瘤的同时，也对机体产生极其严重的毒副反应,从而影响了它在临床上的广
泛应用.TNF的生物学作用是由二种不同的受体TNFR1 (P55)和11«^2 (P75)
介导的.TNF的许多效应是通过TNFRl起作用，TNFR2则起着信号传导作用.
0^11等[3]报道，1斯卩1可通过其死亡域寡聚1狀00，？八00分子，激活MACH/FLICE,启动caspase级联放大效应途径而诱导细胞凋亡.因此TNFRl在多种恶性肿瘤中呈高表达.本研究显示在大肠癌细胞株表面存在1见^1的高表达. 另据文献[4]报道，在大肠癌组织中1犯^1的表达显著高于癌旁及正常组织,与浆膜浸润程度和淋巴结转移呈负相关；日本学者于2003年报道了大肠癌Dukes 0期患者11*«^1高表达者的疾病特异性存活率明显高于低表达者，多因素分析表明了册…表达是一种独立的大肠癌预后预测因子[5].在胆囊癌中，癌细胞
及黏膜上皮细胞几乎无TNFRl的表达，而间质中浸润的单核细胞和血管内皮细胞中可明显见受体表达[6]，这说明TNFRl在肿瘤形成及发展过程中起重要作用，且通过不同途径介导TNF的生物学效应.有研究发现阻断TNFRl可引起胞内凋
亡抑制蛋白（FLIP)的上调，进而抑制细胞凋亡；而阻断TNFR2可引起FLIP
的下调进而促进细胞凋亡[7]推测11«^的功能，一是作为载体内化1~匕二是
激活特定的细胞内部信号传导途径.有人认为丁即与其受体结合，由受体介导的内摄作用使TNF进入细胞，引起细胞溶解及细胞毒作用.
目前发现基质金属蛋白酶在几乎所有肿瘤组织中均存在高活性及高表达. 它不仅能降解基底膜和细胞外基质的大部分成分，还参与释放以前体形式结合于细胞膜上的多种细胞因子和/或生长因子及生长因子受体，成为近年来肿瘤侵袭和转移的研究热点.实验结果显示_9 770叩/此组和1155叩/此组作用
2 11后了见^1表达水平明显低于对照组，而題卩9 154叩/此组，MMP9 385
叩/‘组与对照组无差异，考虑与剂量过低有关，同时也提示觀卩9对大肠癌细胞表面TNFRl的表达的影响与剂量有一定的关系.当MMP9剂量固定为770
叩/此时，作用3，6，9匕后1犯^1表达较对照组相比明显减少，但1.5 11与
对照组比较无差异，可能与酶的最佳作用时间有关.6 h和9 h组比较无差异,
考虑体外环境下，随时间延长酶已失活，提示順?9对1\?^表达的影响与酶的
活性密切相关.本研究说明了，腿四可以按照剂量、时间依赖的方式使大肠癌
SW1116细胞表面的TNFRl表达减少，可能是TNFRl经MMP9水解后，其胞外区
自胞膜脱落后形成sTNFRl. 与Lombard [8]等研究发现人工合成的咖?13和
TIMP2能以剂量依赖的方式减少细胞表面TNF受体的脱落相符.
_5是一类2化+依赖的蛋白水解酶在胚胎发育、形态发生、组织重建及肿
瘤侵袭和转移中发挥重要作用.有观点认为[9] _3促进肿瘤生长、转移是
通过许多机制包括：降解基质、诱导作用及促进血管发生，可能还调节肿瘤细
胞生长.在稳态条件下，ffiPs在组织中的活性几乎测不出，部分是因为低表达，
部分是因为有效的内环境稳态的抑制机制包括金属蛋白酶组织抑制剂.侵袭性
和转移性肿瘤细胞能分泌MMPs及通过周围间质细胞诱导产生MMPs，从而克服
局部组织保持蛋白水解活性平衡的能力.有文献[10] 报道MMP9在Duk eS0和0期中阳性率高于八，3期，且生存期越短表达率越高.Smith等[11]研究认为表达TIMP3的大肠癌细胞通过阻断MMPs能恢复TNFRl的信号途径，并通过自分泌的TNF杀死肿瘤细胞.本实验从另一个侧面说明了MMP9可能通过下调丁吧“表达从而导致肿瘤转移.关于_9促进1即81表达下调的确切机制，尚有待于进一步研究.
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