医学检验--血清酶基本知识

血清酶
（一）血清酶的分类
（二）血清酶生理变异及其病理生理机制
（三）酶活性和质量测定方法及其评价
（四）酶活力测定的影响因素
（五）工具酶
（六）标本采集要点及酶活性表示法
（七）同工酶和亚型测定的临床意义
血清酶的分类
根据酶的来源及其在血清中发挥催化功能的情况，可将血清酶分为两大类。

1.血浆特异酶
在血浆中发挥特定催化作用的酶。

如凝血酶、纤溶酶、胆碱酯酶（CHE）、脂蛋白脂肪酶、铜氧化酶等。

特点：
（1）大多在肝内合成；
（2）以酶原状态分泌入血，在一定的条件下被激活；
（3）有的可以作为肝功能试验的一部分。

血浆特异酶活性的改变，除了反映血液功能外，还反映来源器官的功能。

2.非血浆特异酶
在血浆中浓度很低，且无功能，又可分为两种。

（1）分泌酶：指来源于外分泌腺的酶。

如α-淀粉酶（AMY）、前列腺酸性磷酸酶（ACP）、脂肪酶（LPS）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、ALP等。

在血液中的浓度和其分泌腺体的功能活动和疾病有关，来源增加或排泄受阻时，血浆中此类酶活性增高。

例如，急性胰腺炎时，血淀粉酶就会升高。

（2）细胞酶：
存在于细胞内，参与细胞内新陈代谢的酶。

正常时这些酶存在于组织细胞中，随细胞的不断更新和破坏经常释出极少量进入血液，血浆中酶活性很低。

细胞内、外浓度差异悬殊。

当酶来源的组织细胞发生病变，细胞内酶大量进入血浆，导致血浆酶活性显著增高。

这一类酶临床应用较多，如转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶等，它们在肝病、心脏疾病时都可能出现变化。

血清酶生理变异及其病理生理机制
1.生理变异：
（1）性别：多数酶无性别差异，CK和GGT都是男性高于女性，因此不能以一个参考值作为判断标准。

（2）年龄：如新生儿的CK和LD活性常为成人的2～3倍，ALP和GGT到老年时可能有轻度升高。

（3）进食：酗酒可引起GGT明显升高。

（4）运动：剧烈运动可引起血清中多种酶升高，如CK、LD、AST等。

（5）妊娠与分娩：妊娠时ALP（因有胎盘ALP同工酶）升高，分娩时可能有CK、CK-BB、LD升高。

2.血清酶病理改变机制：
疾病时，影响血清酶的因素很多，主要机制如下：
（1）酶合成异常：
血浆特异酶大多数是在肝合成，当肝功能障碍时酶浓度常下降。

肝功能障碍胆碱酯酶活性下降。

肝-豆状核综合征铜氧化酶活性可明显下降。

骨细胞增生时，血中ALP可上升。

（2）细胞酶的释放：
是疾病时大多数血清酶增高的主要机制，影响细胞酶释放的主要原因有：
1）细胞内、外酶浓度的差异：非血浆特异的酶在细胞内、外浓度可差千倍以上，少量细胞受损伤，就可使血液中酶明显升高。

2）酶在细胞内的定位和存在的形式：胞质中游离的酶如ALT、LD最容易释放入血，线粒体酶较难释放，如AST。

3）酶蛋白分子量的大小：酶释放的速度和分子量成反比，此因素对酶在血液出现时间的影响大于对酶浓度高低的影响。

酶的组织分布对细胞酶的释放也有影响。

（3）酶在细胞外间隙的分布和运送：
细胞中酶有三种途径进入血液。

1）血管内皮细胞和血细胞的酶直接进入血液；
2）酶可同时进入血液和组织间隙，后者再入血；
3）酶大部分进入组织间隙后再入血。

这些因素都会影响酶进入血液的时间和升高的程度。

（4）血液中酶的清除：不同疾病和不同的酶从血液中清除的时间和机制不同，同一疾病不同酶恢复正常的时间也不一样，这和酶的半寿期以及一些其他因素有关。

酶活性和质量测定方法及其评价
酶测定包括酶量测定和酶活性测定。

酶在体液中含量极微，因此临床上大都采用酶活性测定，以酶活性间接表示酶量。

酶活性的概念：酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。

反应速度是指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。

1.酶活性测定方法
（1）按反应时间分类法
1）定时法：（两点法）通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法。

其中t1往往取反应开始的时间。

2）连续监测法：（动力学法或速率法、连续反应法）酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

3）平衡法：（终点法）通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法。

（2）按监测方法分类法
①分光光度法
②旋光法
③荧光法
④电化学方法
⑤化学反应法
⑥核素测定法
⑦量热法
2.酶质量测定法
利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng/ml、μg/L来表示酶含量的高低。

免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响。

酶活力测定的影响因素（酶反应动力学）
影响酶活性的因素包括底物的浓度、酶浓度、酶反应的最适pH、最适温度、酶的激活剂、抑制作用，另外还包括试剂中表面活性剂的作用等因素。

1.反应速度：
大多数酶促反应是可逆反应，其速度既受底物浓度的影响，也受产物生成量的影响。

酶反应动力学中所指速度是反应的初速度。

当底物浓度较高时，在反应的初期，其浓度变化甚微，产物生成量也很少，此时反应速度可看作是恒定的。

2.底物浓度：
米氏方程是反映酶促反应速度与底物浓度关系的方程式：
[S]：底物浓度。

ν：不同[S]时的反应速度。

νmax：最大反应速度。

K m：米氏常数。

K m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。

K m值是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。

不同的酶，K m值不同。

同一个酶有几种底物时，则对每一种底物各有一特定的K m值，其中K m值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。

3.测定酶活力时需注意
（1）酶促反应过程中，要用初速度表示酶促反应速度。

（2）要规定时间、温度、pH等反应条件，并在酶测定过程中保持这些反应条件的恒定。

（3）配制的底物浓度应准确且足够大，底物液中应加入不抑制该酶活力的防腐剂并保存于冰箱中，以防止底物被分解。

（4）标本要新鲜，应保存于冰箱中。

用血浆时，应考虑到抗凝剂对酶反应的影响。

在采血、分离血清时，应注意防止溶血和白细胞的破裂。

（5）在测定过程中，所用仪器应绝对清洁，不应含有酶的抑制物，如酸、碱及蛋白沉淀剂等。

工具酶
作为试剂用于测定化合物浓度或酶活力的酶称为工具酶。

对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应，采用酶耦联法测定。

最简单的酶偶联反应
A：底物
B：待测酶产物（不能直接测定）
C：指示酶产物（可以直接测定）
Ex：待测酶
Ei：代表指示酶（工具酶）
1.NAD（P）十或NAD（P）H偶联的脱氢酶及其指示反应。

340nm监测吸光度变化。

2.偶联H2O2的工具酶及其指示反应
有些酶作用于底物时，可使其氧化产生H2O2，在POD的作用下使色素原氧化显色进行测定。

（1）使单一的色素原显色：色素原是一种无色的色素前身，在过氧化物酶（POD）存在下被H2O2氧化后可生成有色的色素。

如邻联茴香胺（ODA）。

（2）使成对的色素原显色：必须有两个色素原共同存在，再在过氧化物酶（POD）的催化下生成色素。

如酚和4-氨基安替比林作用，生成红色色素。

（3）发光反应：H2O2也可用化学发光反应来监测。

标本采集要点及酶活性表示法
1.部分分析前因素对酶活性测定的干扰
1）溶血：部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外，少量红细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。

2）抗凝剂：有些抗凝剂是金属螯合剂，可以抑制需要金属离子的酶。

如草酸盐、柠檬酸盐和EDTA 等可抑制需Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK，草酸盐可以抑制催化氧化还原的酶，EDTA还能抑制ALP，这些抗凝剂分离的血浆一般不宜做酶活性测定。

肝素可使γ-GT升高，使AMY下降，需加注意。

3）标本储存温度：
血清白蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶（如AST、γ-GT和ALP等）存在于白蛋白中可在室温保存1～3天，而对活性影响不大。

有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在37℃放置1小时，活性可下降50%。

大部分酶在低温中可稳定较长时间，标本如在离体后不能及时测定，应及时分离血清或血浆并置于冰箱冷藏。

2.标本采集要点
酶测定之前，标本要经过采集、分离血清和储存等过程，酶在血中是处于动态变化过程，血液离开体内后，会有一定变化。

其中任何一个阶段处理不当，都有可能引起测定值变化。

（1）不能溶血：因大多数酶在血细胞中的含量比在血浆中高得多。

如LDH高150倍，ALT高7倍。

（2）及时分离血细胞：防止血细胞内酶大量进入血清；采血后1～2小时实验室必须及时离心，分离血清。

（3）及时测定：防止酶蛋白变性，分离血清如不能及时测定，应放冰箱保存。

（4）尽量用血清标本：防止某些抗凝剂对酶的抑制作用（除非测定与凝血或纤溶有关的酶）。

（5）有些标本不能冷冻：有的酶在低温下不稳定。

有些酶如LD在融冻时被破坏，LD在低温反而不如室温稳定，即所谓的“冷变性”。

3.酶活性表示法
酶活性的大小通常以酶单位数表示。

酶的国际单位：在实验规定的条件下（温度、最适pH、最适底物浓度时），在1分钟内催化1μmol 底物发生反应所需的酶量为1个酶活力国际单位（U）。

能够真正代表酶活性大小的是酶促反应初速度。

同工酶和亚型测定的临床意义
1.概述
同工酶是指其分子组成及理化性质不同但具有相同催化功能的一组酶。

同工酶是一个酶族，可以根据同工酶的差异用各种物理、化学方法将其分离测定。

同工酶的结构差异可引起酶蛋白抗原性的变化，现在利用免疫原理来测定同工酶的方法有了很大发展。

2.分布特点
（1）明显的组织器官特异性；
（2）细胞内定位不同；
（3）有些同工酶在不同发育阶段类型不同。

3.临床应用
同工酶的检测比单测总酶活性有更高的灵敏度和特异性。

（1）可根据同工酶的变化来推测受损的组织或器官。

心肌有损伤时虽然可有总LD活性上升，但诊断意义不大，如果LD1活性上升，且LD1＞LD2则说明有心肌疾病。

（2）可判断某些疾病的程度和预后
用的较多的是线粒体AST，此酶较难进入血清，但当肝病变严重、细胞坏死时，线粒体同工酶可进入血中使其升高，对判断疾病的程度和预后都有帮助。

同工酶亚型：有些同工酶在从组织进入体液后，可进一步分化为几个不同的类型，即同工酶亚型。

CK-MB的亚型有MB1、MB2，CK-MM的亚型有MM1、MM2、MM3。

这些亚型对心肌梗死的诊断和溶栓效果的判断都优于CK-总酶和同工酶。