超声辅助提取_分散液相微萃取分析鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫

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粮油食品科技 第 21 卷 2013 年 第 3 期
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1． 4 色谱条件 色谱柱为 C18 柱 （ 250 × 4． 6 mm I． D． ） ， 柱温为
Yaghoub A． 等［3］ 率先提出的一种集采样、 萃取和浓 。 缩于一体的样品前处理技术 其突出优点是微量萃 取剂在分散溶剂的作用下， 在样品溶液中形成无数 微小液滴， 萃取剂用量少且与水相接触面积很大 ， 可 快速达到传质平衡， 萃取几乎不受萃取时间的影响， 可以达到很高的富集倍数和萃取效率。 同时， 它还 具有操 作 简 单、 快 速、 费 用 低、 对环境友好等优 ［4 ］ 点 。本文将超声辅助提取和分散液相微萃取相 结合， 并与高效液相色谱法联用， 建立一种检测鱼肉 中孔雀石绿和结晶紫的新方法。样品经过超声辅助 提取后， 采用分散液相微萃取富集净化， 用高效液相 色谱法测定鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫的残留量。 该方法用于实际鱼肉样品的测定， 结果令人满意。
1 － 乙腈提取 + 甲醇卒取； 2 － 乙腈提取 + 萃取； 3 － 甲醇提取 + 萃取 图1 不同的溶剂对超声提取和 DLLME 萃取的影响
超声提取时间 实验中考察了超声提取 10 ～ 30 min 时对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫的提取效 率的影响（ 图 2） 。实验结果表明： 随着超声提取时间 2． 1． 2 的延长， 鱼肉样品中孔雀石绿和结晶紫的提取效率增 加， 提取也更完全， 因此本实验选择超声提取 30 min。
室温， 流动相为乙腈 + 50 mmol / l 乙酸铵缓冲溶液 （ pH = 4. 5 ） = 70 + 30 ， 流 速 1． 0 mL / min， 进样量 20 μL， 600 nm 在 波长处检测孔雀石绿和结晶紫。
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结果与分析
超声辅助提取的条件优化
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提取溶剂的种类 超声辅助提取中提取溶 剂与其后 DLLME 中分散剂的种类选择范围有所重 叠。水产品中残留的孔雀石绿和结晶紫一般用乙腈
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超声辅助提取 — 分散液相微萃取分析 鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫
肖 琴， 姚 欣， 曾珈智， 麦淑文
( 中山大学 公共卫生学院， 广东 广州 510080 ) 摘 要： 将超声辅助提取和分散液相微萃取相结合， 并 与 高 效 液 相 色 谱 法 联 用， 建 立 一种 检 测 鱼 肉 中孔雀石绿和结晶紫的新方法。实验中分别考察了超声辅助提取的溶剂种类、 提取时间与次数， 分 散液相微萃取的萃取剂与分散剂的种类和体积、 萃 取时间等因素 的影响。 鱼 肉 样 品 经 过 超 声辅 助 提取后， 采用分散液相微萃取富集净化， 用高效液相色谱法测定鱼肉中的孔雀石绿和结晶紫的残留 。 ， 量 在优化的实验条件下 该方法的线性范围 孔雀石绿 和 结 晶 紫 均 为 0． 002 ～ 1 μg / mL， 相 关 系数 为 0． 997 7 ～ 0． 998 8 。孔雀石绿的检出限为 3． 6 μg / kg， 结 晶 紫 为 2． 4 μg / kg。 百度文库 方法 对 鱼 肉 样 品 RSD 为 5． 51% ～ 14． 26% 。方法简单快速、 的回收率为 90． 17% ～ 103． 86% ， 准确可行， 而且有机溶 剂用量少， 被成功地应用于鱼肉中孔雀石绿和结晶紫残留的测定。 关键词： 超声辅助提取; 分散液相微萃取; 鱼肉; 孔雀石绿; 结晶紫 中图分类号： R115 ； R155． 5 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561 （ 2013 ） 03 － 0080 － 05
XIAO Qin， YAO Xin， ZENG Jia － zhi， MAI Shu － wen （ College of Public Health， Sun Yat － sen University， Guangzhou Guangdong 510080 ） Abstract： A new method based on ultrasonic － assisted extraction （ UAE ） and dispersive liquid － liquid microextraction （ DLLME ） with high performance liquid chromatography（ HPLC ） was proposed for the analysis of malachite green （ MG ） and crystal violet （ CV ） in fish meat． The effect of solvent， the extraction the number of extraction， extractant and dispersant were studied． After being extracted by UAE ， entime， riched and purified by DLLME ， the fish meat sample was tested by HPLC to determine the residue of malachite green and crystal violet． Under the optimized experimental conditions， linear response data were obtained in the concentration range of 0． 002 ～ 1 μg / mL for MG， CV with correlation coefficients 0． 997 7 ～ 0． 998 8． The detection limit was 3． 6 μg / kg for MG and 2． 4 μg / kg for CV． The recovery rates were 90． 17% ～ 103． 86% ， relative standard deviations were 5． 51% ～ 14． 26% ． This new established method is simple and fast， accurate and feasible． It can be successfully applied for the determination of MG and CV in fish． Key words： ultrasound － assisted extraction（ UAE ） ； dispersive liquid － liquid microextraction（ DLLME ） ； fish； malachite green； crystal violet MG） 和结晶紫 （ crys孔雀石绿（ Malachite green， tal violet， CV ） 同属于碱性三苯甲烷类染料， 具有类 似的结构， 在水产养殖过程中， 常作为杀菌剂和抗寄 生虫药， 用于防治各种鱼病。 它们在生物体内代谢
生 成 的 产 物 具 有 高 毒 性， 高残留和致畸致癌作 ［1 ］ 用 。世界上许多国家已将孔雀石绿列为水产养 殖禁用药， 我国也宣布了严禁在水产养殖中使用孔 雀石绿和结晶紫， 并规定其不得检出。 孔雀石绿和 结晶紫是近年来食用水产品卫生安全中重点监控的 ［2 ］ 有机污染物 。 分散液相 微 萃 取 （ dispersive liquid － liquid microextraction， DLLME ） 是 2006 年由 Mohammad R． 和
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而 DLLME 中的分散剂多选用甲醇， 但两 进行提取， 。 种不同溶剂共存影响未知 实验中考察了使用乙腈 作为超声辅助提取的提取剂、 甲醇作为 DLLME 萃 取的分散剂， 乙腈同时作为提取剂和分散剂， 甲醇同 对鱼肉中孔雀 时作为提取剂和分散剂 3 种条件下， 石绿和结晶紫残留的超声辅助提取和 DLLME 萃取 的影响（ 图 1 ） 。 结果表明， 甲醇同时作为超声辅助 提取的提取剂和 DLLME 萃取的分散剂时， 鱼肉中 。 本 孔雀石绿和结晶紫残留的萃取效果最好 因此， 实验选择甲醇作为超声提取的提取剂 。
图2
不同超声提取时间对 MG 和 CV 的提取效果比较
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2． 1． 3 提取次数 实 验 中 还 考 察 了 提 取 次 数 为 1 ～ 3 次时对鱼肉中孔雀石绿和结晶紫的提取效率 的影响 （ 图 3 ） 。 实 验 结 果 表 明 ： 随 着 提 取 次 数 的 增加 ， 鱼肉样 品 中 孔 雀 石 绿 和 结 晶 紫 的 提 取 效 率 增加 ， 提 取 也 更 完 全， 提 取 3 次 的 效 果 最 好。 因 此， 本实验选择提取次数为 3 次 ， 离心后合并三次 上清液 。
Determination of malachite green and crystal violet in fish by ultrasound － assisted extraction combined with dispersive liquid － liquid microextraction
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材料与方法
仪器与试剂
高效液相色谱仪（ 带紫外检测器） ， 电子天平， 氮 pH 酸度计， 气吹扫仪， 超声波处理仪， 台式离心机等。 孔雀 石 绿 （ MG ） 、 结 晶 紫 （ CV ） 、 四 氯 化 碳、 氯 苯、 二氯甲烷、 三氯甲烷、 甲醇、 乙腈、 丙酮、 乙醇、 盐 酸羟胺、 冰乙酸、 对甲苯磺酸、 乙酸铵、 酸性氧化铝和 所用的其他试剂均为分析纯及以上纯度， 实验用水 为高纯水。 1． 2 超声辅助提取 取广州市售的皖鱼样品， 去鳞、 去皮， 沿背脊取肌 肉部分， 用均质机均质后保存于 － 20 ℃ 冰箱中待用。 称取 0． 5 g 均质后的鱼肉装入 15 mL 离心管 CV 标准溶液， 添加一定量的 MG、 混匀， 在室温 内， 下静置 15 min， 制成加标样品。 加入 0． 05 mol / l 对 20% 盐酸羟胺溶液 0． 15 mL 甲苯磺酸溶液 0． 25 mL、 和 1 mL 甲醇， 混匀后， 加入 0． 5 g 酸性氧化铝， 振荡 4 ℃ 下以 4 000 r / min 混匀 2 min， 超声提取 30 min， 15 min ， 离心 将上层澄清液体转移至 10 mL 容量瓶 中。再向离心管中加入 1 mL 甲醇提取两次， 方法同 上。 合并三次上清液， 加入 0． 2 g NaCl 溶解， 用高纯 水定容至 10 mL 制成待测样品溶液， 经 0． 45 μm 的 针头过滤器过滤后待用。 1． 3 分散液相微萃取操作 移取 5 mL 样品溶液于 15 mL 玻璃离心管内 ， 用注射器将 250 μL 萃取剂二氯甲烷和 2． 2 mL 分 散剂甲醇的 混 合 液 快 速 注 入 样 品 溶 液 中 ， 溶液形 成乳浊体 系 且 较 长 时 间 不 消 失 ， 静 置 2 min 。 在 4 ℃ 下以3 000 r / min 的转速离心 5 min ， 分散的二 氯甲烷 颗 粒 将 沉 积 到 离 心 管 底 部 ， 形 成 有 机 相。 用 100 μL 微 量 进 样 器 抽 取 一 定 体 积 的 下 层 有 机 相， 氮气吹至近干 ， 再溶于两倍体积的流动相进行 HPLC 分析 。
收稿日期： 2012 － 10 － 18 基金项目： 广东省自然科学基金资助项目（ 9451008901002266 ） ； 高校 基本科研业务费中山大学青年教师培育项目（ 12ykpy14 ） ； 广东省大学生创新训练项目（ 1055812373 ） 1979 年出生， 作者简介： 肖琴， 女， 湖北宜昌人， 博士， 讲师．