轮叶党参发酵工艺的研究

第３５卷　第２期２０１３年６月 延　边　大　学　农　学　学　报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．２

　Ｊｕｎ．２０１３收稿日期：２０１３－０２－１１　基金项目：国家科技部国际合作专项基金（ＯＳ２０１２ＺＲ００６４）作者简介：俞星（１９７８—）

，女（朝鲜族），吉林延吉人，延边大学医学院讲师，博士。轮叶党参发酵工艺的研究

俞星１，　韩春姬１，　李美子

２

（１．延边大学医学院；２．延吉市中医医院：吉林延吉１３３０００

）摘要：为探讨用活性酵母发酵轮叶党参的最佳条件，以总皂苷含量为观察指标，采用正交设计方法对发酵所需的活性酵母剂量、发酵天数、发酵温度等因素进行优化，用ＭＴＴ法对发酵前后正丁醇萃取物对ＨｅｐＧ－２细胞的增殖抑制作用进行了比较。结果表明，轮叶党参药材中添加活性酵母１％，发酵７ｄ，发酵温度３０℃所得到的总皂苷含量最高，发酵后的正丁醇萃取物４００ｍｇ／Ｌ组对ＨｅｐＧ－２细胞的抑制作用显著高于相应的未发酵剂量组（Ｐ＜０．０１）。因此，轮叶党参最佳发酵条件为用１％的活性酵母发酵７ｄ，发酵温度３０℃，发酵后的４００ｍｇ／Ｌ组的抑制作用显著高于相应的未发酵剂量组。关键词：轮叶党参；发酵；总皂苷

中图分类号：Ｒ２８４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４－７９９９（２０１３）０２－０１１９－０４

轮叶党参（Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ　Ｌａｎｃｅｏｌａｔａ　Ｂｅｎｈｔ　ｅｔ　Ｈｏｏｋ　ｆ，ＣＬ）又名羊乳、山胡萝卜、山海螺、四叶参，属桔梗科党参属植物，是药食兼用的植物根，广泛分布于我国东北、华北、华东和中南地区以及朝鲜、日本、俄罗斯等地。在我国延边及朝鲜、韩国、日本等地区长期以来将其作为上等野菜食用，无任何毒副作用，我国已把轮叶

党参列为食用山野菜［

１－２

］。近年来，微生物发酵技术越来越广泛的应用于中药研究，通过发酵，提高活性成分的含量或产生新的活

性成分，从而提高药效［３］

。最近，本实验室研究的结果表明，发酵轮叶党参正丁醇部位能明显诱导人肝癌细胞Ｈｅｐ

Ｇ－２的凋亡［４］，发酵轮叶党参乙醇提取物清除自由基的能力明显提高［５］

。为了探讨发酵轮叶党参的最佳条件，对影响发酵及提取率的主要因素进行优化，为轮叶党参药材的进一步开发和应用提供理论依据。

１　材料与方法

１．１　材料

轮叶党参为采自吉林省安图县的３年生根茎，ＤＭＥＭ培养基为ＧＩＢＣＯ公司产品；特级胎牛血清购自北京华美生科生物技术有限公司；ＭＴＴ粉剂为Ｓｉｇｍａ公司产品；活性酵母为哈尔滨马利酵母有限公司产品；人参皂苷Ｒｅ对照品购自中国药品生物制品检定所；

其它试剂均为市售分析纯。主要仪器有ＲＥ－５２Ｄ旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂）、ＵＶ－２５５０（日本岛津）、ＣＯ２培养箱（Ｓａｎｙｏ公司）、酶联免疫检测仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）。人肝癌细胞ＨｅｐＧ－２由延边大学肿瘤研究中心惠赠。

１．２　发酵工艺的正交试验设计

选择轮叶党参发酵时间（Ａ）、发酵用活性酵母剂量（Ｂ）及发酵温度（Ｃ）

作为考察因素，每个因素选择３个水平，采用Ｌ９（３４）正交设计（表１）。１．３　提取工艺流程

轮叶党参粉末中加入适量蒸馏水混合，高压灭菌，待冷却后在无菌条件下加入活性酵母，在恒温箱内发酵。发酵结束后，用５０％乙醇回流提取３次，

回收乙醇，除多糖后浓缩至浸膏。

延　边　大　学　农　学　学　报

第３５卷　

表１　正交试验因素和水平Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｌａｙｏｕｔ　ｄｅｓｉｇ

ｎ水平Ｌｅｖｅｌ因素ＦａｃｔｏｒＡ／ｄ　Ｂ／％Ｃ／℃１　２　１　２０２　４　２．５　３０３　

７　

５　

４０

１．４　轮叶党参总皂苷含量测定

以人参皂苷Ｒｅ为对照品，

采用香草醛－冰乙酸－高氯酸法显色，利用紫外分光光度计测定吸光度，以此来计算不同工艺提取的轮叶党参总皂苷含量［

６－７

］。１．５　标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液０．０１，０．０２，０．０４，０．０８，０．１６ｍＬ于１０ｍＬ具塞试管中，温水浴挥干溶剂，加５％香草醛冰醋酸溶液０．２ｍＬ，高氯酸０．８ｍＬ，混匀，密塞，置于６０℃水浴中加热１５ｍｉｎ后立即用流水冷却，加冰醋酸５ｍＬ，摇匀，于５６０ｎｍ处测定吸光度，绘制标准曲线，得回归方程为Ａ＝０．１９０　２Ｃ－０．１７３　６，Ｒ＝０．９９８　９。１．６　对Ｈｅｐ

Ｇ－２细胞的抑制作用取对数生长ＨｅｐＧ－２细胞，用含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液调整肿瘤细胞浓度至１×１０４

个／ｍＬ接种于９６孔板，每孔２００μＬ，在３７℃、５％ＣＯ２条件下培养。待细胞贴壁后，

每孔加入待测物２０μＬ，使其终浓度达到６００、４００、２００、１００ｍｇ／Ｌ，另设空白对照组（加入含等量ＰＢＳ），继续培养７２ｈ后，每孔加入ＭＴＴ溶液（５ｇ／Ｌ）２０μＬ，继续在培养箱内孵育４ｈ，取出倾去上清液，每孔加入１５０μＬ　

ＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ后，使用酶联免疫检测仪在４９２ｎｍ处测定各孔吸光度。按以下公式计算细胞增殖抑制率。

细胞生长抑制率＝（对照组平均Ａ值－实验组平均Ａ值）／对照组平均Ａ值×１００％。１．７　统计学分析　

所得数据全部用ＳＰＳＳ１７．０统计软件包进行统计学处理。多组比较采用单因素方差分析；方差齐时用ＬＳＤ－

ｔ检验，方差不齐时用Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｔ检验做两两比较。各组实验数据以ｘ±ｓ表示，检验水准α＝０．０５。２　结果与分析

２．１　发酵条件优化

表２　发酵的轮叶党参最佳工艺正交试验方案及皂苷含量

Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｐｒｏｇ

ｒａｍ　ａｎｄ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｃｏｄｏｎｏｐｓｉｓ　ＬａｎｃｅｏｌａｔａＮｏ．Ａ／ｄ　Ｂ／％Ｃ／℃Ａ５６０１　２　１　２０　０．１４６２　２　２．５　３０　０．１６５３　２　５　４０　０．１５４４　４　１　３０　０．１５７５　４　２．５　４０　０．１５５６　４　５　２０　０．１５１７　７　１　４０　０．２２１８　７　２．５　２０　０．１６１９　７　５　３０　０．２１５

Ｋ１　０．１５５　０．１７４　０．１５３Ｋ２　０．１５４　０．１６０　０．１７９Ｋ３　０．１９９　０．１７３　０．１７７Ｆ　５．１４４　５．１４０　５．１４２Ｒ

＜０．

０１＜０．

０１＜０．

０１０

２１